Synthesis and Characterization of Phenylboronic acid Conjugated Methyl Cellulose-Polyethylenimine Copolymer for Drug and Gene Co-delivery System

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 바이오시스템.소재학부(바이오소재공학전공), 2017. 2. 김태일.본 연구에서는 메틸셀룰로오스(Methyl cellulose, MC)-폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, PEI) 공중합체 주쇄 고분자에 페닐보론산을 도입한 약물·유전자 동시전달시스템을 개발하였다. 우선 MC를 산화시킨 후 분자량 2000 Da의 PEI를 접합시켜 주쇄 고분자인 MCPEI2k를 합성하고, 페닐보론산(Phenylboronic acid, PBA)을 도입시켜 양친매성을 갖는 MCPEI-PBA를 합성하였다. 1H NMR을 통해 MCPEI2k는 9.87개의 글루코사민 단위체당 1개의 PEI 분자가 부착되었음을, MCPEI-PBA에서는 PEI 한 분자 당 3.6개의 PBA가 붙었음을 확인하였다. PBA의 형광소광현상을 통해 PBA와 PEI 간에 B-N 결합이 존재함을 확인하였고, 이를 통해 고분자의 입자 형성 가능성을 확인하였다. 실제로 파이렌 흡광법을 통해 7.43×10-2 ㎎/㎖의 임계응집농도를 계산했고, 동적광산란계 및 투과전자현미경을 통해 입자 크기와 형태를 확인했다. 이후 pDNA와의 폴리플렉스 형성 능력을 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동 실험을 진행하였고, MCPEI-PBA는 무게비 1 이상에서 완전한 폴리플렉스를 형성하였다. 동적광산란계를 통해 200 ㎚ 이하의 크기와 약 20-60 mV 사이의 표면전하를 갖는 폴렉플렉스임을 확인하였다. MCPEI-PBA의 세포독성을 확인하기 위해 MTT 실험을 진행하였고, 실험에 사용한 모든 세포에서 분자량 25000 Da의 PEI인 PEI25k 보다 독성이 낮음을 확인했다. 하지만 간암세포의 한 종류인 HepG2 세포에서 유독 독성이 높은 것을 통해 이 세포와 특이적인 상호작용을 하고 있음을 알 수 있었다. 또한 트랜스펙션(transfection) 효율 평가 실험을 통해 PEI25k와 MCPEI2k에 비해 우수한 전달 효율을 가지고 있음을 확인하였고 그 정도가 HepG2에서 특히나 큰 것을 다시금 알 수 있었다. 이후 트랜스펙션 효율 평가 실험, 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP) 발현 실험, 세포 투과율 평가 실험에서 갈락토오스 전처리 과정을 추가함으로써 MCPEI-PBA와 HepG2 세포의 아시알로당단백질 수용체(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR) 간의 상호작용이 있음을 확인할 수 있었다. 그 다음 MCPEI-PBA의 입자 내부에 독소루비신(Doxorubicin, DOX)을 담지하였다. 담지된 약물의 양은 DLE(Drug Loading Efficiency) 100.3%, DLC(Drug Loading Content) 8.8%로 계산되었다. 수용액상에서 DOX가 담지된 MCPEI-PBA/DOX와 pDNA를 복합화 시킨 MCPEI-PBA/DOX/pDNA 폴리플렉스는 각각 287 ㎚, 259 ㎚의 입자를 가졌다. pDNA 복합화를 통해 나노입자가 보다 조밀하고 균일하게 형성되었다. 또한 모두 양전하를 띠는 것을 확인함을 통해, 효과적으로 세포내로 침투 가능한 조건을 갖는 것을 예상할 수 있었다. DOX 전달을 통한 암세포 사멸효과를 확인하고자 MTT 실험을 진행한 결과, 내부에 담지된 DOX 농도가 10 ㎍/㎖ 이상일 때 같은 양의 DOX를 단독 처리 했을 때에 비해 MCPEI-PBA/DOX의 암세포 사멸효과가 높게 나타났다. 또한 세포 투과율 평과를 통해서 MCPEI-PBA/DOX가 세포 내로 효율적으로 전달되고 있음을 확인했다. 끝으로 세포자멸을 일으키는 유전자인 pJDK-apoptin을 함께 전달시켜 약물·유전자 동시전달의 가능성을 살펴보았다. DOX나 pJDK-apoptin 중 단일 물질만 전달시킨 경우보다 둘을 동시에 전달시킨 MCPEI-PBA/DOX/pJDK-apoptin에서 세포가 가장 잘 죽는 것으로 나타나, 최종적으로 MCPEI-PBA 합성 고분자의 아시알로당단백질 수용체를 통한 HepG2 세포로의 우수한 약물·유전자 전달시스템으로서의 가능성을 보였다.1. 서 론 1 2. 문헌연구 5 2.1 다당류를 이용한 약물 및 유전자 전달시스템 5 2.1.1 메틸셀룰로오스 기반의 약물 및 유전자 전달시스템 5 2.1.2 기타 다당류의 약물 및 유전자 전달시스템으로서의 활용 6 2.2 페닐보론산을 이용한 약물 및 유전자 전달시스템 8 2.2.1 의료용 소재로서의 페닐보론산의 특징 8 2.2.2 약물 및 유전자 전달시스템에서의 페닐보론산의 활용 11 2.3 암세포 치료를 위한 약물 및 유전자 전달시스템 13 2.3.1 독소루비신을 함유하는 약물 전달시스템 연구 13 2.3.2 세포자멸을 유도하는 치료용 유전자 전달시스템 연구 16 3. 재료 및 방법 17 3.1 재 료 17 3.2 실험방법 18 3.2.1 페닐보론산 도입을 통한 MCPEI-PBA의 합성 18 3.2.2 MCPEI-PBA의 특성 분석 19 3.2.2.1 1H NMR을 이용한 구조 분석 19 3.2.2.2 GPC를 이용한 분자량 측정 19 3.2.2.3 PBA의 형광소광현상을 이용한 입자 형성 가능성 확인 20 3.2.2.4 파이렌 흡광법을 이용한 임계응집농도 측정 20 3.2.2.5 DLS를 이용한 평균 입자 크기 확인 21 3.2.2.6 TEM을 이용한 입자 형태 확인 21 3.2.3 MCPEI-PBA/pDNA 폴리플렉스의 특성 분석 21 3.2.3.1 pDNA의 추출 및 정제 21 3.2.3.2 아가로스 젤 전기영동을 통한 폴리플렉스 형성 확인 22 3.2.3.3 DLS를 이용한 폴리플렉스의 평균 입자 크기 및 표면전하 확인 22 3.2.4 MCPEI-PBA의 세포실험 23 3.2.4.1 세포배양 23 3.2.4.2 MTT 실험을 통한 MCPEI-PBA의 세포 독성 평가 23 3.2.4.3 트랜스펙션 실험을 통한 MCPEI-PBA의 세포 내 유전자 전달 효율 평가 24 3.2.4.4 녹색 형광 단백질 발현을 통한 MCPEI-PBA의 세포 내 유전자 전달 효율 평가 25 3.2.4.5 유세포 분석법을 이용한 폴리플렉스의 세포 투과율 평가 25 3.2.5 독소루비신을 담지한 MCPEI-PBA 제조 26 3.2.6 MCPEI-PBA/DOX의 특성 분석 27 3.2.6.1 MCPEI-PBA/DOX의 독소루비신 함량 확인 27 3.2.6.2 DLS를 이용한 MCPEI-PBA/DOX와 MCPEI-PBA/DOX/pDNA의 평균 입자 크기 및 표면전하 확인 27 3.2.6.3 TEM을 이용한 MCPEI-PBA/DOX의 형태학적 확인 28 3.2.6.4 독소루비신 방출 평가 28 3.2.7 MCPEI-PBA/DOX의 세포실험 28 3.2.7.1 MTT 실험을 통한 MCPEI-PBA/DOX의 암세포사멸능력 평가 28 3.2.7.2 유세포 분석법을 이용한 MCPEI-PBA/DOX의 세포 투과율 평가 29 3.2.7.3 MTT 실험을 통한 MCPEI-PBA/DOX/pJDK-apoptin 폴리플렉스의 암세포사멸능력 평가 29 4. 결과 및 고찰 31 4.1 MCPEI-PBA의 합성 및 구조 특성 31 4.1.1 MCPEI-PBA의 합성 31 4.1.2 MCPEI-PBA의 구조 및 분자량 확인 33 4.1.3 입자 형성 가능성 확인 38 4.1.4 임계응집농도 확인 41 4.1.5 평균 입자 크기 및 형태 확인 43 4.2 MCPEI-PBA/pDNA 폴리플렉스의 구조 특성 46 4.2.1 MCPEI-PBA/pDNA 폴리플렉스의 형성 확인 46 4.2.2 MCPEI-PBA/pDNA 폴리플렉스의 평균 입자 크기 및 표면전하 확인 48 4.3 MCPEI-PBA의 생물학적 평가 51 4.3.1 MCPEI-PBA의 세포 독성 평가 51 4.3.2 혈청 유무 조건에서의 세포 트랜스펙션 효율 평가 54 4.3.3 녹색 형광 단백질 발현 이미지를 통한 세포 트랜스펙션 효율 평가 61 4.3.4 MCPEI-PBA/pDNA 폴리플렉스의 세포 내 투과율 평가 63 4.4 MCPEI-PBA/DOX의 특성 분석 65 4.4.1 MCPEI-PBA/DOX의 독소루비신 함량 확인 65 4.4.2 MCPEI-PBA/DOX와 MCPEI-PBA/DOX/pDNA의 평균 입자 크기 및 표면전하 확인 67 4.4.3 MCPEI-PBA/DOX의 형태학적 구조 69 4.4.4 독소루비신 방출 평가 71 4.5 MCPEI-PBA/DOX의 생물학적 평가 74 4.5.1 MCPEI-PBA/DOX의 암세포사멸능력 평가 74 4.5.2 MCPEI-PBA/DOX의 세포 투과율 평가 77 4.5.3 MCPEI-PBA/DOX/pJDK-apoptin 폴리플렉스의 암세포사멸능력 평가 79 5. 결 론 81 참고문헌 83 Abstract 96Maste