삼중음성 유방암에서 olaparib과 PI-103 동시 사용 시의 방사선감수성 증강작용 확인 및 그 기전에 대한 연구

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 의학과, 2014. 8. 김인아.서 론: 삼중음성 유방암은 공격적인 임상양상을 보이지만 특별한 치료 목표물이 없어서 치료 방법에 제한이 있어 왔다. 삼중음성 유방암이 BRCA 돌연변이가 있는 유방암과 많은 비슷한 임상적, 병리적 특성을 가진다는 점과 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) 억제제가 BRCA 돌연변이 환자에게서 임상적으로 성과를 거둔 점에 착안하여 PARP 억제제를 삼중음성 유방암에 도입해보았으나, 실제 임상에서 PARP 억제제 단독 사용은 효과가 없었다. 방사선은 DNA 이중나선절단을 유도하고 phosphoinositide 3-kinase (PI3K) 신호전달체계는 상동재조합 (homologous recombination)을 유지 조절하는데 필요한 것으로 알려져 있으며, 최근의 전임상연구에 따르면 PI3K를 억제하면 BRCA1/2의 발현이 억제되어서 BRCA 돌연변이가 없는 삼중음성 유방암에서도 PARP 억제제의 감수성을 증가시킨다고 한다. 이를 바탕으로 BRCA 돌연변이가 없는 삼중음성 유방암에서 olaparib과 PI-103을 동시에 사용하여 방사선감수성을 증강시킬 수 있는지 확인하고 그 기전에 대해 연구해보았다. 방법: MDA-MB-435s 세포를 방사선치료 단독, olaparib + 방사선치료, PI-103 + 방사선치료, olaparib + PI-103 + 방사선치료, 이렇게 4개의 치료군으로 나누어 실험하였다. 세포를 방사선조사 2시간 전에 약물처리 하였으며, 세포생존곡선은 집락형성 분석법을 이용하여 구하였다. 웨스턴 블로팅과 γH2AX foci에 대한 면역형광법을 실시하고, 생체내 방사선감수성 평가를 위해 쥐에 세포주를 이종이식한 뒤 생체발광영상을 이용하였다. 결과: Olaparib과 PI-103의 동시 사용은 MDA-MB-435s (SER0.05 1.7)와 MDA-MB-231-BR (SER0.05 2.1) 세포주를 이용한 생체외 실험에서 방사선감수성을 증가시켰으며 또한 이종이식 모델에서도 종양부피를 현저하게 감소시켰다. (p < 0.001). PI-103을 처리했을 때 DNA 나선절단의 복구가 지연되었음을 의미하는 지속된 γH2AX foci가 관찰되었으며, phosphorylated extracellular signal–regulated kinase과 poly(ADP-ribose)의 상승과 BRCA1의 감소가 나타났다. 결론: Olaparib과 PI-103을 동시 사용은 MDA-MB-435s, MDA-MB-231-BR 세포주와 이종이식 모델에서 모두 방사선감수성을 증가시켰다. 삼중음성 유방암은 국소재발과 원격전이 확률이 모두 높으며, 최근의 방사선치료는 국소질환뿐 아니라 뇌전이나 소수 전이암 같은 원격전이 질환에 대해서도 중요한 역할을 담당하고 있다. PARP 억제제와 함께 PI3K 신호전달체계를 억제하는 치료 전략은 이러한 BRCA 야생형 삼중음성 유방암 환자들에게 있어서 방사선치료 효과를 높이는데 응용할 수 있는 기초 전략이 될 수 있을 것으로 생각된다.Introduction: Triple negative breast cancer (TNBC) shows aggressive clinical behavior but the treatment options are limited due to lack of a specific target. TNBC shares many clinical and pathological similarities with BRCA deficient breast cancer, for which poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor is effective, but PARP inhibitor alone failed to show clinical effects in patients with sporadic TNBC. Radiation induces DNA double strand break and the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling pathway has been known to regulate steady state levels of homologous recombination. Recent preclinical study showed that PI3K inhibition impairs BRCA1/2 expression and sensitizes BRCA-proficient TNBC to PARP inhibition. Taken together, we assessed the radiation sensitizing effect of combined olaparib and PI-103 in BRCA-proficient triple negative breast cancer cells and investigated its mechanism of action. Methods: MDA-MB-435s cells were divided into four treatment groupsirradiation (IR) alone, olaparib + IR, PI-103 + IR, olaparib + PI-103 + IR. Cells were exposed to the drugs for 2 hours prior to irradiation, and the cell survival curve was obtained using a clonogenic assay. Western blotting and immunofluorescent detection of γH2AX foci were performed. Xenograft and bioluminescence imaging were performed to assess in vivo radiosensitivity. Results: Combined use of olaparib and PI-103 enhanced the radiation-induced cell death of MDA-MB-435s (SER0.05 1.7) and MDA-MB-231-BR (SER0.05 2.1) cell lines. In addition, the tumor volume was significantly reduced with the use of radiation plus the two-drug combination in the xenograft models (p < 0.001). Treatment with PI-103 showed prolonged γH2AX foci, indicating delayed DNA strand break repair. PI-103 was found to induce upregulation of phosphorylated extracellular signal–regulated kinase (ERK), increase of poly(ADP-ribose), and downregulation of BRCA1. Conclusions: Combined use of olaparib and PI-103 enhanced the radiation-induced cell killing effect in BRCA-proficient MDA-MB-435s and MDA-MB-231-BR cell lines and xenograft. TNBC patients have high incidences of locoregional relapse and distant metastasis, and radiation therapy is involved not only in locoregional control, but also in the treatment of distant recurrences such as brain metastasis or other oligometastasis. Targeting of the PI3K signaling pathway combined with PARP inhibition could be a reasonable approach to enhance effects of radiation in BRCA-proficient TNBC.Abstract ...........................................................................................................ⅰ Contents...........................................................................................................ⅲ List of figures...................................................................................................ⅳ Introduction.......................................................................................................1 Materials and Methods......................................................................................3 Cell culture......................................................................................................3 Pharmacologic inhibitors................................................................................3 siRNA transfection..........................................................................................3 Clonogenic assay.............................................................................................3 Western blotting..............................................................................................4 Immunofluorescence of γH2AX.....................................................................5 In vivo tumor model.......................................................................................5 Results...............................................................................................................7 Combined use of olaparib and PI-103 enhanced radiation induced cell killing in TNBC cells......................................................................................7 Combined use of olaparib and PI-103 enhanced in vivo radiation induced cell killing.......................................................................................................9 PI-103 induced prolongation of γH2AX foci.................................................9 PI-103 induced upregulation of ERK and downregulation of BRCA1........12 Discussion........................................................................................................13 References.......................................................................................................17 국문초록.........................................................................................................21Docto