Proteomic profiling을 통한 살모넬라 외막소포체 단백질 규명 및 특성분석

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 식품공학과, 2013. 8. 유상렬.살모넬라는 전 세계적으로 넓은 범위의 동물뿐만 아니라 사람에게도 살모넬라증 이라 불리는 질병을 유발하는 주요 식중독 원인 균 중 하나이다. 외막소포체는 살모넬라를 비롯한 많은 그람 음성균 에서 분비되며 박테리아 생존, 영양분 획득, 항균제제에 대한 저항 그리고 바이오 필름 형성 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나 소포체 형성 및 분비 기작에 대해서는 많이 알려진 바가 없다. 이에, 본 연구에서는 살모넬라의 독성과 생리적 기능에 있어 외막소포체의 기능을 이해하고자 proteomics 프로파일링을 수행하였다. 이를 위해 서로 다른 두 가지 배양 조건에서 외막소포체를 분리, 정제하고 그 구성 단백질 성분을 LC-MS/MS 방법을 이용하여 확인 하였다. LC-MS/MS 분석 결과에 따르면 탄소와 지방 대사에 관련한 효소, 리보솜 단백질, 수송 단백질 심지어는 SPI-1 과 2 단백질 또한 두 조건 모두에서 분비 되었다. 흥미로운 점은 리보솜 단백질은 LB배지 조건에서, 수송 단백질은 산성 제한배지 조건 에서 분비된 외막소포체 각각에서 보다 다량으로 분비 되었으며 이러한 배지에 따른 외막소포체 단백질 구성의 차이는 다양한 환경 변화에 따른 특이적인 외막소포체 형성 매커니즘이 존재함을 제시한다. 나아가, 산성 제한배지 조건에서만 특별하게 분비되는 다양한 단백질 중, hupA, glnH 그리고 phoN 유전자에 의해 암호화된 단백질들은 각각 대식세포에 감염되어 대식세포의 세포질로 분비되는 단백질임을 확인 하였다. Immunoblotting을 통해 세 개의 단백질 중 GlnH 그리고 PhoN 단백질은 숙주 내 환경과 유사한 조건에서 외막소포체에 존재함을 다시 확인 하였다. 또한, 이들 각각의 기능이 소실된 변이균주들은 대식세포에 감염 시 병원성이 떨어지는 것으로 나타났다. 이 단백질들이 외막소포체와는 별개로 세균의 생존에 관여하는 가능성을 배제 할 수는 없으나 이 결과는 외막소포체를 통해 분비 된 HupA, GlnH 그리고 PhoN 단백질이 살모넬라의 숙주 내 생존에 있어 중요한 역할을 할 것임을 제시한다. 또한, 외막소포체를 통해 분비 된 수송 단백질이 대식 세포 내 살모넬라 성장에 관여한다는 것을 알아냈다. PstS, DppA, CysP, STM14_1918 또는 YcfM 단백질이 결여 된 균주에서 생존 능력의 감소가 나타난 반면 RbsB, PotD, PagL, TggE, MetQ 또는 YehZ가 결여된 균주에서는 생존 능력이 증가했다. 살모넬라 생존과 스트레스 저항에 있어서 이러한 수송체들의 구체적인 역할은 추후 연구를 통한 확인이 필요할 것이나, 이 결과는 살모넬라 생존과 관련한 세포 외막 수송 단백질의 부차적인 기능의 가능성을 시사한다.Salmonella is one of major food-poisoning pathogen causing diverse health problems called salmonellosis in a wide range of animals as well as human all over the world. Outer membrane vesicles (OMV) are secreted in many Gram-negative bacteria including Salmonella and play diverse roles including bacterial survival, nutrient acquisition, resistance to antimicrobial agents and biofilm formation, while the biogenesis of vesicles formation and secretion is not fully understood yet. In this study, OMV proteomic profiling was performed in order to understand OMV roles in Salmonella virulence and physiology. OMV were purified under two different culture conditions and their constituents were analyzed by LC-MS/MS. Proteins secreted via OMV in both conditions included enzymes related to carbon and lipid metabolisms, ribosomal proteins, transporters and even SPI-1 and 2 proteins. Interestingly, ribosomal proteins were abundant in the vesicles isolated from LB condition whereas transporters in those from acidic minimal medium and this culture-dependent difference in OMV protein constituents suggested the existence of specific mechanism in sorting proteins as cargo during vesiculation in response to environments.Among a variety of proteins secreted via OMV specifically under acidic minimal condition, 3 proteins encoded by hupA, glnH and phoN genes were translocated into the macrophage cytosol. Moreover, mutant strains lacking HupA, GlnH or PhoN were attenuated in survival inside macrophages. Immunoblotting verified the presence of these proteins in OMV isolated under acidic minimal medium mimicking intracellular environment. These results suggest that HupA, GlnH, and PhoN may play roles in Salmonella intracellular survival following secretion via OMV, although it cannot be ruled out that these proteins are also important for bacterial viability independent of OMV secretion. Also, transport proteins contained in OMV were found to affect Salmonella growth after macrophages infection. Salmonella strains without 5 transport proteins including PstS, DppA, CysP, STM14_1918, or YcfM showed decreased growth while 6 strains lacking RbsB, PotD, PagL, YggE, MetQ, or YehZ showed increased growth. Although their specific roles in bacterial growth and stress resistance have to be revealed in further study, this result highlights the possibility of additory functions of transporters associated with OMV.CONTENTS ABSTRACT..............................................................................................................I CONTENTS...........................................................................................................III List of Figure...........................................................................................................V List of Table.............................................................................................................V I. INTRODUCTION..............................................................................................1 Ⅱ. MATERIALS AND METHODS.......................................................................5 1. Bacterial strains, growth conditions.............................................................5 2. Construction of bacterial strains and plasmids...........................................5 3. Purification of outer membrane vesicles (OMV).........................................7 4. LC-MS/MS analysis.......................................................................................8 5. Immunoblot anaysis.......................................................................................9 6. Gentamicin protection assay.........................................................................9 7. cAMP assay...................................................................................................10 Ⅲ. RESULTS........................................................................................................18 1. Protein amounts and compositions of outer membrane vesicles are different depending on culture conditions..................................................18 2. LC-MS/MS results showed diverse protein constituents in outer membrane vesicles........................................................................................21 3. HupA, GlnH and PhoN are translocated to the macrophage cytosol...........................................................................................................23 4. GlnH and PhoN proteins were secreted via outer membrane vesicles under in vitro condition................................................................................26 5. Salmonella strains lacking hupA, glnH and phoN were attenuated in survival inside macrophages.......................................................................28 6. OMV-associated transporters influence Salmonella survival inside macrophages.................................................................................................32 Ⅳ. DISCUSSION...................................................................................................36 Ⅴ. REFFERENCES..............................................................................................39 국문초록..................................................................................................................42Maste