Procesos biotecnológicos integrados para la producción y purificación de antígenos del virus del dengue

Fil: Smith, María Emilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaEl dengue es la enfermedad viral transmitida por vectores de mayor importancia en el mundo en términos de morbilidad y mortalidad. Su incidencia ha aumentado enormemente en las últimas décadas y se estima que se producen 390 millones de infecciones cada año. En Argentina, si bien el comportamiento del dengue es epidémico, se verifica la presencia del vector en la mayoría de las provincias. Para su diagnóstico, los enzimoinmunoensayos que permiten la detección de IgM e IgG anti-dengue son métodos muy utilizados en la práctica clínica, debido a su simplicidad y rapidez. Sin embargo, la mayoría de los reactivos disponibles en la actualidad utilizan antígenos obtenidos a partir del virus completo, lo que disminuye su especificidad debido a la reactividad cruzada con otros flavivirus. Por otro lado, los reactivos comerciales que utilizan antígenos recombinantes tienen un alto costo y, por lo tanto, no son accesibles para todos los laboratorios.\nEl objetivo general de este trabajo fue el desarrollo de un proceso integrado para la producción y purificación antígenos del virus del dengue de manera recombinante utilizando plataformas de bajo costo para el desarrollo de un enzimoinmunoensayo diagnóstico. Los antígenos con los que se trabajó fueron la proteína de la envoltura del virus del dengue serotipo 2 (en su versión truncada que carece de la región transmembrana, Et) y su dominio III (DomIII). Estos antígenos se expresaron fusionados con la Hidrofobina I (HFB) de Trichoderma reesei con el fin de purificarlos fácilmente y de manera económica por sistemas de dos fases acuosas (ATPS). Se ensayaron dos sistemas de expresión, uno basado en plantas de Nicotiana benthamiana y el otro basado en células y larvas de insectos utilizando baculovirus recombinantes.\nMediante el sistema de expresión transiente en plantas de N. benthamiana se logró expresar la proteína Et fusionada a HFB (EtHFB), sin embargo, no se logró expresar el DomIII fusionado a HFB (DomIIIHFB). La extracción de EtHFB del tejido vegetal requirió el uso de SDS y DTT como aditivos en el buffer de extracción, lo que imposibilitó su purificación por ATPS con Tritón X-114.\nPara la expresión en células y larvas de insectos se desarrollaron baculovirus recombinantes conteniendo el cassette de expresión para EtHFB y para DomIIIHFB. Se estudió la expresión de las proteínas recombinantes en células de la línea Sf9 infectadas con los baculovirus. Si bien se esperaba encontrar las proteínas en el sobrenadante de cultivo, EtHFB fue completamente retenida en el interior celular, mientras que DomIIIHFB fue en parte liberada al medio extracelular. La extracción de EtHFB del interior celular requirió, al igual que lo sucedido en plantas, de la adición de SDS y DTT al buffer de extracción, hecho que imposibilitó su posterior purificación por ATPS. Se ensayó la purificación DomIIIHFB desde el sobrenadante de cultivo por ATPS utilizando tres concentraciones de Tritón X-114: 2, 5 y 8% y, si bien la proteína se concentró, el grado de pureza alcanzado fue del 20% en la mejor condición (2% de Tritón X-114).\nPor otro lado, se estudió la expresión de EtHFB y DomIIIHFB en larvas de Rachiplusia nu infectadas con los baculovirus recombinantes. En este sistema, se obtuvieron altos niveles de expresión para DomIIIHFB (4,5 mg/g de larva), pero no fue posible evidenciar la expresión de EtHFB. DomIIIHFB pudo ser extraída de las larvas con buffer PBS sin aditivos, lo que permitió estudiar su purificación por ATPS con Tritón X-114. Se ensayó la purificación a partir de extractos crudos de larvas, utilizando Tritón X-114 al 2, 5 y 8%. Se alcanzó una pureza superior al 80% al utilizar un 2% de Tritón X-114 (mejor condición) en un solo paso y con un rendimiento del 73%. La identidad de la proteína purificada fue confirmada por espectrometría de masa, por el análisis de los péptidos obtenidos luego de su digestión con tripsina. De esta manera, se logró obtener una plataforma de bajo costo para la producción de DomIIIHFB, basada en su producción en larvas de R. nu y su purificación por ATPS con Tritón X-114 al 2%.\nCon el antígeno así obtenido se desarrolló un enzimoinmunoensayo de tipo indirecto para la detección de inmunoglobulinas anti-dengue en suero de pacientes. Para ello, se estudió la inmovilización de DomIIIHFB en placas multipocillo, tanto hidrofílicas como hidrofóbicas, y se compararon los resultados con aquellos obtenidos inmovilizando DomIII (sin el tag de HFB). DomIIIHFB se inmovilizó eficientemente en ambos tipos de placas, mientras que DomIII sólo lo hizo en aquellas de tipo hidrofílico. Se seleccionaron las placas hidrofóbicas de poliestireno para el inmunoensayo, dado que son las más económicas. Se optimizó la inmovilización del antígeno en esta superficie y se determinó que con la cantidad de DomIIIHFB obtenida a partir de una larva, se pueden producir 22 placas de 96 pocillos sensibilizadas.\nEn cuanto a la detección de inmunoglobulinas anti-dengue en el suero de pacientes infectados por el virus, se vio que el inmunoensayo desarrollado fue capaz de detectar sólo IgG anti-dengue serotipo 2 y no así de los otros serotipos. Además, no presentó inmunorreactividad cruzada cuando se ensayaron sueros de pacientes positivos para otros flavivirus (virus de la Fiebre amarilla y virus de la encefalitis de San Luis). Estos resultados si bien son preliminares, ya que se estudió un bajo número de sueros, son muy alentadores dado que permitirían disponer de un inmunoensayo para la serotipificación de una infección por el virus del dengue en la etapa de convalecencia, lo que en la actualidad se realiza por ensayos de neutralización, que son sumamente engorrosos y complejos y que sólo se encuentran disponibles en laboratorios de referencia