Deslignificación enzimática de materiales lignocelulósicos de interés industrial

La presente Tesis aborda el estudio de tratamientos enzimáticos (basados en la utilización de lacasas en presencia de mediadores redox) encaminados a eliminar/modificar la lignina y/o lípidos presentes en materiales lignocelulósicos de interés industrial, con el fin de conseguir un aprovechamiento más eficaz y racional de dichos materiales, tanto para la producción de celulosa como de biocombustibles de segunda generación (bioetanol). La importancia de los lípidos en la materia prima radica en que son responsables de la formación de los denominados depósitos de pitch durante la fabricación de pasta y papel, reduciendo drásticamente la calidad del producto final y provocando importantes pérdidas económicas. Por otra parte, tanto el contenido como la composición y estructura de la lignina influyen decisivamente en el proceso de deslignificación de la lignocelulosa afectando tanto a los procesos de cocción y blanqueo (en la producción de celulosa) como en la sacarificación enzimática (en la producción de bioetanol). En esta Tesis se han utilizado lacasas de alto potencial redox, de los hongos basidiomicetos Trametes villosa y Pycnoporus cinnabarinus y de bajo potencial redox como la lacasa del hongo ascomiceto Myceliophthora thermophila. Los tratamientos enzimáticos se realizaron en presencia y ausencia de mediadores redox tanto sintéticos, como el 1-hidroxibenzotriazol (HBT), como fenólicos incluyendo siringaldehído (SA) y siringato de metilo (MeS). Los materiales lignocelulósicos utilizados incluyeron pastas kraft de eucalipto para los estudios de deslignificación/blanqueo y eliminación de lípidos responsables del pitch, y madera de eucalipto (Eucalyptus globulus) y hierba elefante (Pennisetum purpureum) para los estudios de deslignificación como pretratamiento previo a la sacarificación enzimática para la obtención de bioetanol. En los tratamientos de pasta kraft de eucalipto con la lacasa de M. thermophila (MtL) en presencia de los mediadores fenólicos SA y MeS, los mejores resultados de deslignificación (25%) y aumento de blancura (8.3 puntos) de dichas pastas se obtuvieron en el tratamiento con MtL y MeS (seguido de extracción alcalina con peróxido). Sin embargo, la mayor eliminación de los compuestos lipofílicos se consiguió en el tratamiento con MtL en presencia de SA como mediador, produciéndose una disminución del 73% de esteroles libres, 91% de glicósidos de esteroles y del 89% de ésteres de esteroles. Estos tratamientos incluyeron la optimización de las dosis enzima-mediador obteniéndose unos resultados muy prometedores con unas dosis tanto de lacasa como de MeS aceptables para su implementación industrial. Estos resultados fueron la base para la realización de un ensayo de este tratamiento enzimático a escala piloto que se llevó a cabo en el ¿Centre Technique du Papier¿ (Grenoble, Francia). Otros estudios estuvieron encaminados al desarrollo de pretratamientos enzimáticos basados en la utilización del sistema lacasa-mediador para deslignificar materiales lignocelulósicos procedentes de cultivos de crecimiento rápido (eucalipto y hierba elefante) con el objeto de mejorar el rendimiento de la sacarificación enzimática y la producción de bioetanol. Primeramente se realizaron tratamientos de estos materiales con una lacasa de alto potencial redox (de T. villosa) y HBT como mediador, en una secuencia que incluía cuatro tratamientos enzimáticos seguidos cada uno de ellos de una extracción alcalina con peróxido de hidrógeno (8 pasos). Tras la secuencia completa se determinó el contenido en lignina (lignina Klason) y se evaluó el rendimiento de la sacarificación enzimática (con celulasas) y fermentación de las muestras pretratadas. Con estos pretratamientos se consiguió una eliminación de lignina de un 48% en la madera de eucalipto y de un 32% en la hierba elefante, que conllevaron una mejora en el rendimiento de la liberación de glucosa de un 61% y 12% y de producción de etanol de 4 g/L y 2 g/L en la madera de eucalipto y hierba elefante, respectivamente, respecto de las muestras sin pretratamiento enzimático. Además de la variación en el contenido en lignina del material lignocelulósico tras los pretratamientos, se estudió la modificación estructural del polímero de lignina mediante el análisis de las muestras por Resonancia Magnética Nuclear bidimensional (2D-NMR). Estos estudios revelaron una eliminación significativa de las unidades guayacilo (G) y siringilo (S) de la lignina así como de las cadenas laterales (principalmente uniones ß-O-4¿) y una disminución más moderada del contenido en ácido p-cumárico (presente en la hierba elefante) sin una variación sustancial de las señales de polisacárido. Estos análisis también mostraron una oxidación en el C¿ de las unidades S de la lignina que fue más evidente en el caso de la madera de eucalipto. Con el fin de facilitar la viabilidad industrial de este pretratamiento enzimático basado en el sistema lacasa-mediador, posteriormente se estudiaron pretratamientos enzimáticos de madera de eucalipto en condiciones similares a los anteriormente descritos, pero utilizando un sistema lacasa-mediador de más bajo coste, que consistió en la utilización de una lacasa comercial (MtL) y de un mediador fenólico (MeS). Tras el pretratamiento completo (cuatro ciclos) se obtuvo una eliminación del 50% del contenido en lignina de la madera de eucalipto así como un aumento de un 40% en la liberación de glucosa tras sacarificación enzimática, respecto de las muestras sin pretratamiento enzimático. La modificación estructural de la lignina producida por estos pretratamientos se estudió en profundidad mediante 2D-NMR. Estos análisis revelaron una eliminación significativa de las unidades guayacilo (G) y siringilo (S) de la lignina con preferencia de las primeras, así como de las cadenas laterales (principalmente uniones ß-O-4¿ y ß-ß¿). La modificación más relevante observada fue la oxidación en el C¿ de las unidades S. En estos pretratamientos se llevó a cabo un estudio detallado por 2D-NMR de la modificación estructural de la lignina tras cada uno de los 8 pasos (incluyendo tratamientos enzimáticos y extracción alcalina) tanto en el material lignocelulósico completo como en las ligninas aisladas enzimáticamente y en los filtrados de los tratamientos, lo que ha aportado información de gran interés sobre el mecanismo de degradación de la lignina por el sistema lacasa-mediador y que será de ayuda para desarrollar pretratamientos enzimáticos viables industrialmente