Study of protein composition in the invasion area of squamous cell carcinoma by proteomics based on mass spectrometry  

Orientador: Adriana Franco Paes LemeTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Câncer de cabeça e pescoço é um grupo de câncer que envolve a cavidade oral, faringe e laringe. A maioria dos casos é de carcinoma oral de células escamosas ou epidermóide (CEC), o qual apresenta alta morbidade. Em câncer, mudanças no estroma dirigem a invasão e metástase, cujos processos são característicos da malignidade. Evidências recentes sugerem que a área do fronte invasivo dos carcinomas, ou seja, na interface do tumor-hospedeiro, apresenta perfil molecular e características morfológicas diferentes em comparação a outras áreas do mesmo, sendo considerada como uma região de interesse para a identificação de potenciais assinaturas de prognóstico. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi identificar as proteínas presentes no estroma do fronte invasivo do tumor em comparação ao estroma do interior do tumor. Para isso, a microdissecção a laser (LMD) foi associada à espectrometria de massas (MS), técnicas consideradas de alta robustez quando combinadas para a identificação e quantificação de proteínas em tecidos tumorais de regiões específicas. Vinte amostras teciduais fixadas em formalina e parafina de CEC de língua foram utilizadas para isolar o estroma da região do fronte invasivo e o estroma do interior de tumores por LMD, seguida de extração e digestão das proteínas e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas in tandem por proteômica baseada em descoberta (LC-MS/MS). A partir das análises, incluindo análises estatísticas e a correlação com os dados clínico-patológicos dos pacientes, cinco proteínas foram encontradas estatisticamente significantes em relação as suas abundâncias entre as regiões do fronte invasivo e do interior do estroma tumoral. As abundâncias de COL6A1 (Collagen alpha-1(VI) chain), FSCN1 (Fascin-1), ITGAV (Integrin alpha-V), MB (Myoglobin) e THBS2 (Thrombospondin-2) foram associadas ao estadiamento clínico do paciente, à presença de metástase linfonodal, à recorrência de metástase linfonodal e ao grau de diferenciação histomorfológica do tumor (p-valor<0,05, R<-0,7 ou 0,70,5). Dentre essas proteínas, a localização de COL6A1 e MB foram confirmadas por imunohistoquímica em um novo conjunto de amostras de CEC oral (n=96 casos) e as proteínas COL6A1 e ITGAV foram associadas as características infiltração capsular do linfonodo, margens livres e recorrência regional. Uma vez que a ocorrência de metástase linfonodal é o principal fator associado ao pior prognóstico de CEC oral, a presença dessas proteínas foi avaliada em amostras de saliva de pacientes com CEC oral com metástase linfonodal (n=10) e em pacientes sem metástase linfonodal (n=23). Por meio da análise proteômica baseada em alvos pelo método de monitoramento seletivo de reações (SRM) foi demonstrado que COL6A1 e ITGAV (Integrin alpha-V) estão menos abundantes em amostras de saliva de pacientes com metástase linfonodal, com capacidade de classificar pacientes com ausência e presença de metástase com alta sensibilidade (COL6A1: 0,739; ITGAV: 0.696) e especificidade (COL6A1: 0,9; ITGAV: 0,8). Portanto, este trabalho demonstra pela primeira vez por meio da combinação das técnicas de LMD e MS proteínas com distribuição espacial distinta entre as regiões de fronte invasivo e interior tumoral, presentes no estroma e também em saliva de pacientes com CEC oral, sendo capazes de distinguir entre pacientes com e sem metástase linfonodal, apresentando assim potencial valor prognóstico. Os presentes resultados indicam proteínas candidatas que podem ser associadas ao prognóstico para CEC de boca que podem guiar estratégias terapêuticas na prática clínicaAbstract: Head and neck cancers are a group of cancers that involve the oral cavity, pharynx and larynx. The majority of head and neck cancers are squamous-cell carcinoma (SCC), which has high morbidity. In cancer, changes in the stroma drive invasion and metastasis, the hallmarks of malignancy. Recent evidence suggests that the invasive tumor front area of carcinomas, ie, the tumor-host interface, have different molecular profile and distinct morphological features compared to other areas of the tumor and may be considered as a region of interest to identify prognostic markers. Thus, the aim of this study is to identify the proteins present in the stroma of the invasive tumor front compared to the stroma of the inner tumor. The combination of laser microdissection (LMD) and mass spectrometry (MS) has been considered as an approach with high robustness to protein identification of specific regions of tumor tissues. Twenty samples of CEC of tongue tissues fixed in paraffin and in formalin were used to isolate the stroma from the invasive tumor front and from the inner tumor by LMD, followed by protein extraction, protein digestion and liquid-chromatography coupled to mass spectrometry in tandem by discovery-based proteomics (LC-MS/MS). Statistical analysis and correlation analysis with clinicopathological data revealed five spatially distinct proteins between the stroma regions. The abundance of COL6A1 (Collagen alpha-1(VI) chain), FSCN1 (Fascin-1), ITGAV (Integrin alpha-V), MB (Myoglobin) and THBS2 (Thrombospondin-2) were associated to clinical stage, lymph node metastasis and lymph node recurrence (p-valor<0.05, R<-0.7 or 0.70.5). The location of COL6A1 and MB were confirmed by immunohistochemistry in a new set of 96 patient samples of oral SCC (OSCC) and association to lymph node capsular infiltration, margin status and local recurrence. Once lymph node metastasis is the main poor prognostic factor in OSCC, the selected proteins were evaluated in saliva samples of patients with metastasis (n=10) and without metastasis (n=23). Targeted proteomics analysis based on SRM method (Selected Reaction Monitoring) demonstrated that COL6A1 and ITGAV were found with lower abundance in patients with lymph metastasis and able to distinguish between the two groups of samples by ROC analysis with high sensitivity (COL6A1: 0.739; ITGAV: 0.696) and high specificity (COL6A1: 0.9; ITGAV: 0.8). Taken together, by the association of LMD and MS (DDA and SRM) approaches, this project demonstrate for the first time proteins spatially organized in the stroma of different regions of the tumor, the invasive tumor front and the inner tumor, that are also present in saliva samples of OSCC patients and able to distinguish between those with metastasis and without metastasis, thus, with potential prognostic value. These results indicate new candidate prognosis markers for OSCC that may guide therapeutic strategies in clinical routineDoutoradoFármacos, Medicamentos e Insumos para SaúdeDoutora em Ciências2013/16483-0FAPES