Amplificação da região 16S-23S do RNA ribossomal de Staphylococcus aureus e sua aplicação no estudo das infecções hospitalares

Orientador : Marcelo de Carvalho RamosDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A caracterização das bactérias em níveis subespecíficos, relacionando isolados em cepas, tem grande aplicação no estudo das infecções dentro do ambiente hospitalar. Permite fazer inferências sobre a extensão de surtos, rotas de transmissão e avaliação de medidas empregadas para controle. Os métodos de tipagem podem ser divididos em fenotípicos, quando se baseiam em características expressas pelo organismo, ou genotípicos, quando a comparação se dá pelo seu material genético. Estes últimos apresentam vantagens sobre os primeiros pois são baseados em características mais estáveis e menos sujeitas a pressões ambientais. O Staphylococcus aureus é um germe bastante comum tanto no ambiente hospitalar, quanto na comunidade, sendo responsável por quadros clínicos de gravidade variável. A técnica considerada de escolha para a genotipagem desse microorganismo é a Eletroforese em Gel com Campo Pulsátil, PFGE. Esse método exige aparato caro, é trabalhoso e fornece resultados somente após 4-5 dias de trabalho. E, portanto, importante a padronização de métodos mais simples e que forneçam resultados em prazos menores de tempo. Com o objetivo de avaliar a tipabilidade, reprodutibilidade e poder discriminatório para a tipagem de Staphylococcus aureus pela amplificação da região 16S - 23S do RNA ribossomal, ribotipagem por PCR, desenvolveu- se o presente estudo. O primeiro passo foi a escolha do par de iniciadores. Escolheu-se o par que produzia menores fragmentos e facilitava a interpretação dos resultados. A reprodutibilidade e tipabilidade foram também avaliadas e mostraram ser bastante satisfatórias. A etapa seguinte foi tipar 88 isolados de S. aureus obtidos do Hospital Municipal Dr. Mário Gatti, um hospital terciário em Campinas, SP. Dentre os 27 isolados oxacilina sensíveis, foi possível identificar 22 genótipos distintos. O coeficiente de similaridade por "Simple Matching" variou de 45 a 100%. Obteve-se apenas um único perfil genotípico dentre os 61 isolados oxacilina resistentes. Estes resultados demonstram que, por possuir boa tipabilidade, reprodutibilidade, ser de fácil execução e interpretação, a técnica de ribotipagem por PCR deve ser considerada para a tipagem de Staphylococcus aureus oxacilina sensíveis. No grupo de bactérias oxacilina resistentes, houve monotonia no padrão genotípico, fato que ocorre também com outras técnicas. Existe necessidade do desenvolvimento de técnicas, talvez como seqüenciamento de regiões conservadas do genoma, para que possam ser feitas inferências sobre a ancestralidade de isoladosAbstract: Strain typing represents an important tool for understanding the epidemiology of nosocomial infections. It is useful to determine the extension of outbreaks and routes of transmission, for example. The available techniques nowadays can be based on characteristics expressed by the organisms, fenotyping methods, or on genomic material, genotyping methods. The former ones are based on more stable characteristics and provide better results in terms of reproducibility, typeability, and discriminatory power. Staphylococcus aureus is a major pathogen both in community and in hospital setting. Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE, is the current method of choice for this bacteria but it is laborious, requires expensive apparatus, and the results are available only after 4 to 5 work-days. It is necessary to develop simpler methodologies, that can give results in shorter periods of time. We evaluate in this study the polymorphism in the spacer regions between the 16S and 23S units of the rRNA genes, PCR based ribotyping, as a strain typing technique for S. aureus. The first step was to choose the most suitable primer pair and the technique was then checked for reproducibility, stability and typeability. These preliminary results were satisfactory. We had chosen the primer pair that produced the smallest amplicons, which allowed better analysis. The discriminatory power was assessed using a collection of 88 isolates from Hospital Municipal Dr. Mário Gatti, a general tertiary-care hospital in Campinas, São Paulo State, Brazil. The results obtained from the 61 methicillin resistant isolates produced one single pattern, but it was possible to identify 22 different patterns among the 27 methicillin sensitive isolates. The bands could be visualized in the agarose gels with simple Ethidium Bromide staining, which permits the use of computer based software to compare band patterns. Given the results and the technical simplicity, PCR based ribotyping appears to be useful in strain typing S. aureus methicillin sensitive isolates, but the discriminatory power among the methicillin resistant isolates seems to be poor. There is a crescent need to develop and standardize new techniques to genotype bacteria, such as DNA sequencing, in order to evaluate the relatedness among isolatesMestradoClinica MedicaMestre em Clinica Medic