Meiotic progression of mouse spermatogonia in vitro

La spermatogenesi è un processo complesso attraverso il quale le cellule germinali mitotiche vanno incontro a proliferazione, differenziamento, divisione meiotica e cambiamenti morfologici per produrre spermatozoi maturi. L’entrata in meiosi delle cellule germinali mitotiche, gli spermatogoni, è un evento critico per il loro differenziamento in condizioni di La spermatogenesi è un processo complesso attraverso il quale le cellule germinali mitotiche vanno incontro a proliferazione, differenziamento, divisione meiotica e cambiamenti morfologici per produrre spermatozoi maturi. L’entrata in meiosi delle cellule germinali mitotiche, gli spermatogoni, è un evento critico per il loro differenziamento in condizioni di abbiamo osservato che SM attiva il signaling della fosfatidilinositolo 3 kinasi (PI3K) e favorisce l’ultimo round di replicazione del DNA nelle cellule allo stadio di preleptotene permettendone il loro ingresso in meiosi. L’effetto positivo della microgravità sul differenziamento delle cellule germinali è stato osservato anche su culture di cellule spermatogoniali indifferenziate Kit negative che in RCCS acquisiscono il recettore Kit ed esprimono Stra8. In conclusione il presente studio dimostra che la microgravità è una condizione ambientale che può giocare un ruolo importante nel differenziamento delle cellule germinali e fornisce uno strumento per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano lo switch dal ciclo cellulare mitotico a quello meiotico nei mammiferi. 2) per quanto riguarda il secondo approccio, il ruolo esatto del sistema endocannabinoide (ECS) nella spermatogenesi non è stato ancora bene identificato. Abbiamo usato frazioni di cellule germinali purificate rappresentative di tutte le fasi della spermatogenesi e culture primarie di spermatogoni. Questo metodo garantisce la precisa quantificazione dei livelli dei ligandi dei recettori dei cannabinoidi, l’anandamide e il 2-­‐arachidonoilglicerolo, e l’espressione a livello trascrizionale e tradizionale dei loro enzimi metabolici e dei recettori. I nostri dati indicano che le cellule germinali maschili di topo possiedono un attivo e completo ECS, il quale è modulato durante la meiosi, e suggerisce la presenza di un segnale endocannabinoide autocrino durante la spermatogenesi. Le cellule mitotiche possiedono livelli più elevati del 2-­‐arachidonoilglicerolo, il quale diminuisce negli spermatociti e negli spermatidi. Di conseguenza, gli spermatogoni esprimono livelli più alti dell’enzima che sintetizza il 2-­‐arachidonoilglicerolo e livelli più bassi dell’enzima che lo degrada, rispettivamente , in confronto alle cellule meiotiche e postmeiotiche. Questo endocannabinoide gioca probabilmente un ruolo fondamentale nel promuovere la progressione meiotica delle cellule germinali attivando i recettori CB2. In effetti, abbiamo constatato che l’agonista specifico per il recettore CB2, JWH133, induce la fosforilazione delle Erk1/2 MAPK negli spermatogoni e la loro progressioneverso la meiosi, perché incrementa il numero di cellule SCP3 positive, un marker della profase meiotica, e l’espressione di geni precosi della profase I della meiosi.Spermatogenesis is a complex process by which mitotic germ cells undergo proliferation, differentiation, meiotic division and cell morphological changes to produce mature sperm. The entry into meiosis of mitotic germ cells, spermatogonia, is a critical step of germ cell differentiation in cell culture conditions. Up to now, only two agents, all-­‐trans retinoic acid (ATRA) and Kit ligand (KL) have been postulated to have a role in the induction of meiotic entry in male mitotic germ cells. I report two new approaches that we have developed to induce meiotic entry of spermatogonia: 1) in microgravity conditions and 2) after activation of the endocannabinoid system. 1) concerning the first approach we report that mouse mitotic spermatogonia cultured under Simulated Microgravity (SM) with a rotary cell culture system (RCCS) enter into meiosis in the absence of any added exogenous factor or contact with somatic cells. We found that isolated Kit-­‐positive spermatogonia under RCCS conditions enter into the prophase of the first meiotic division (leptotene stage), as monitored by chromosomal organization of the synaptonemal complex 3 protein (Scp3) and up-­‐regulation of several pro-­‐meiotic genes. SM was found to activate the phosphatidyl inositol 3 kinase (PI3K) pathway and to induce in Kit-­‐positive spermatogonia the last round of DNA replication, typical of the preleptotene stage. A positive effect of SM on germ cell differentiation was also observed in undifferentiated (Kit-­‐negative) spermatogonia, in which RCCS conditions stimulate the expression of Kit and Stra8. In conclusion, SM is an artificial environmental condition which promotes postnatal male germ cell differentiation; it might provide a tool for studying the molecular mechanisms underlying the switch from mitosis to meiosis in mammals. 2) concerning the second approach, the endocannabinoid system (ECS) during spermatogenesis has not been clarified. We used purified germ cell fractions representative of all phases of spermatogenesis and primary cultures of spermatogonia. This approach allowed the precise quantification of the cannabinoid receptor ligands, anandamide and 2-­arachidonoylglycerol, and of the expression at transcriptional and transductional levels of their metabolic enzymes and receptors. Our data indicate that male mouse germ cells possess an active and complete ECS, which is modulated during meiosis, and suggest the presence of an autocrine endocannabinoid signal during spermatogenesis. Mitotic cells possess higher levels of 2-­‐arachidonoylglycerol, which decrease in spermatocytes and spermatids. Accordingly, spermatogonia express higher and lower levels of 2-­‐arachidonoylglycerol biosynthetic and degrading enzymes, respectively, as compared to meiotic and postmeiotic cells. This endocannabinoid likely plays a pivotal role in promoting the meiotic progression of germ cells by activating CB2 receptors. In fact, we found that the selective CB2 receptor agonist, JWH133, induced the Erk 1/2 MAPK phosphorylation cascade in spermatogonia and their progression towards meiosis, because it increased the number of cells positive for SCP3, a marker of meiotic prophase, and the expression of early meiotic prophase genes