Deficiency of ribosomal protein S19 (RPS19) causes the reduction of translation elongation and rRNA production

La biogenesi ribosomali è un processo la cui regolazione è in accordo alla crescita cellulare. Si ritiene, infatti, che la sintesi dell’rRNA e delle proteine ribosomali sia finemente controllata da meccanismi mirati a coordinarla, così da evitare alla cellula inutili sprechi di energia. Per studiare questi meccanismi abbiamo alterato il naturale processo di produzione dei ribosomi down-regolando la sintesi della proteina strutturale della subunità piccola del ribosoma S19 (RPS19), nella linea cellulare leucemia mieloide delle K562C, tramite un sistema di interference specifico. Cellule private di RPS19 mostravano una diminuzione dei livelli delle altre proteine ribosomali apparteneti sempre alla subunità minore del ribosoma (RPS), mentre non presentavano modulazioni rilevabili sulla quantità delle proteine costituenti la subunità grande dello stesso (RPL). Come conseguenza è stato possibile osservare un accumulo della subunità 60S e un arresto della proliferazione e della crescita cellulare. È stato osservato che la diminuzione delle RPS non dipendeva da una regolazione trascrizionale dei loro messaggeri e che nessuna RP esisteva in forma libera nel citoplasma delle cellule interferate per RPS19. Sorprendentemente, la deficienza di RPS19 induceva il reclutamento di tutti i messaggeri delle RP sui polisomi, suggerendo un aumento della loro attività traduzionale. Lo stesso fenomeno è stato osservato in altre linee cellulari (TF-1C e PC3), anche in seguito a interference di altre proteine ribosomali (RPS6 e RPL11). Ulteriori analisi hanno mostrato che il caricamento sui polisomi dei RP mRNA indotto dall’interference di RPS19 era parzialmente bloccato da trattamento con inibitori della proteina mTOR (mammalian target of rapamycin), quali rapamicina e wortmannina. L’osservazione di un’associazione con i polisomi dei messaggeri delle RP era però in antitesi con l’osservazione di una diminuita quantità di RPS, così per cercare una spiegazione a tale fenomeno abbiamo studiato la stabilità delle proteine ribosomali in cellule interferate per RPS19. Il trattamento con l’inibitore del proteasoma ha mostrato che non c’era aumento di degradazione proteica indotta dall’interference. L’analisi della misurazione del tasso di allungamento di traduzione ha indicato, invece, che la carenza di RPS19 causava nelle cellule un rallentamento dell’attività dei ribosomi. Dunque, l’osservato aumento di associazione dei RP mRNA con i polisomi potrebbe essere spiegato come un’alterazione del rapporto tra inizio ed allungamento della traduzione e potrebbe non voler indicare un aumento della sintesi di proteine ribosomali. La conseguenza della riduzione di RPS19 consisterebbe in una riduzione della sintesi proteica globale dovuta probabilmente a una diminuzione del tasso di allungamento. Inoltre, il turn-over delle RPS potrebbe essere maggiore di quello delle RPL tanto da provocare uno sbilanciamento delle subunità del ribosoma. D’altra parte, in cellule K562C e TF-1C la diminuzione di RPS19 causava la riduzione dei livelli del precursore degli rRNA maturi, il 47S, ma non ne modifica la stabilità. In ultima analisi, linee cellulari linfoblastoidi di pazienti affetti da anemia di Diamond Blackfan, caratterizzati da mutazioni in geni di proteine ribosomali, presentavano la stessa diminuzione dei livelli di 47S osservati nelle linee cellulari interferate per RPS19 da noi analizzate.Ribosome biogenesis is a process regulated according to cell growth. The synthesis of rRNAs and ribosomal proteins (RP) are thought to be controlled by mechanisms aimed to coordinate them thus avoiding unnecessary waste of energy. To study these mechanisms we altered the production of RPS19 in the erythroleukemia cell line K562 by siRNA-mediated down regulation. RPS19-depleted cells showed a decrease of the other RPs of the small ribosomal subunit (RPS), but not of the RP of the large subunit (RPL). As a consequence an accumulation of 60S subunits was observed in RPS19 deficient cells. The decline in RPS level was not due to transcriptional regulation and free cytoplasmic RP were not detected. Unexpectedly, RPS19 deficiency caused a recruitment of all RP mRNAs on polysomes suggesting an increase in translational activity. The same phenomenon was observed in other cell lines (TF-1 and PC3) and after depletion of other RPs (RPS6 and RPL11). Further analysis showed that the polysomal recruitment of RP mRNA induced by RPS19 deficiency was partially inhibited by mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitors rapamycin and wortmannin. To understand how an increase in polysome-associated RP mRNA resulted in the observed decrease of the level of RPSs, we measured the stability of the proteins. The administration of proteasome inhibitor showed that there was not an increase in protein degradation caused by RPS19 deficiency. Finally, the measurement of general elongation rate indicated that the depletion of RPS19 induces a slowing down of ribosome transit time. Therefore the observed increase in RP mRNA polysomal association may be due to the alteration of the ratio initiation/elongation and would not result in an increase of RP synthesis. So, the consequence of RPS19 reduction is a general decrease of RP level due, possibly, to a decline of the elongation rate. In addition, RPS turnover may increase with respect to RPL causing a ribosomal subunit unbalance. On the other hand, in K562C and TF-1C cells, RPS19 depletion causes the reduction of the 47S rRNA production but it does not alter its stability. Finally, also Diamond Blackfan anemia (DBA) lymphoblastoid cell lines, characterized by ribosomal protein mutations, presented the decrease of the rRNA precursor as we found in our cells