Kasvun synteettinen säätely Saccharomyces cerevisiae hiivassa indusoitavalla proteiinidegradaatiolla tuottavuuden parantamiseksi

Yield, titer, and productivity are the major measures determining the industrial feasibility of microbial fermentations. Reaching feasible yields requires drawing substantial resources from growth to production leading to compromised productivity and viability. Due to the inherent competition between the production of biomass and target products, common strategies to improve yield result in low volumetric productivity. Productivity could be enhanced by a time-separation of growth and production phases. While the switch to a production phase occurs due to a natural complex trait in some species under nutrient limitation, it drives most hosts to metabolic quiescence. Generalizable solutions are required for switching the production hosts during a fermentation process from growing state to product synthesis. Therefore, the aim of this work was to engineer a synthetic regulatory system in Saccharomyces cerevisiae for repressing growth essential metabolic enzyme activities and thereby switching from growth to production during a fermentation. The synthetic regulatory system was comprised of the ClpXP proteasome of bacterial origin, inducible from a Tet-ON promoter. The ClpXP proteasome recognises ssrA-tagged proteins and degrades them. Fluorescence from ssrA-tagged Venus protein could be successfully suppressed by inducing the ClpXP proteasome and the suppression was found modifiable by the concentration of inducing agent (doxycycline). Then, the ssrA-tag was introduced individually in the genome to three growth essential metabolic enzymes selected using genome-scale metabolic model simulations. Inducing the degradation of any of the three enzyme targets succeeded in ceasing growth, both with fermentative and respirative carbon sources (i.e. glucose or ethanol, respectively). Quantitative proteomics confirmed that the target enzyme levels were specifically decreased when their degradation was induced. The delay from induction to the growth cessation was found target enzyme dependent. Independent of the enzyme target, the consumption of glucose or ethanol was observed to continue after growth cessation indicating metabolic activity, though the specific uptake rates were decreased compared to the growth phase. Since the cellular metabolism remained active, the synthetic ClpXP regulatory mechanism offers a generalizable solution for improving industrial feasibility of microbial fermentation processes. The results of this work are notable because only industrially feasible microbial fermentations allow replacing petrochemical production processes and thereby tackling climate change and advancing sustainable life.Saanto, tiitteri ja tuottavuus määrittävät mikrobifermentaatioiden teollisen kannattavuuden. Jotta teollinen kannattavuus voitaisiin saavuttaa, mikrobisolut on muokattava ohjaamaan huomattavia määriä resursseja tuotantoon kasvun sijasta. Tällöin kuitenkin solujen elinkelpoisuus ja tuottavuus vaarantuvat. Tuottavuutta voi parantaa erottamalla ajallisesti prosessin kasvu- ja tuotantovaiheet. Tietyt homelajit kykenevät luonnollisesti siirtymään tuotantovaiheeseen, kun solujen ravintoa syöttöliuoksessa rajoitetaan. Ravintorajoitukset ajavat kuitenkin monien isäntäorganismien aineenvaihdunnan lepotilaan eikä monimutkainen luonnollinen kyky siirtyä tuottotilaan ole siirrettävissä muihin isäntäorganismeihin. Yleisiä ratkaisuja tarvitaan tuotanto-organismien tilan ohjaamiseksi fermentaation aikana kasvusta tuotantoon. Tässä työssä on toteutettu synteettisen biologian keinoin Saccharomyces cerevisiae hiivaan säätelymekanismi, jolla solujen tila voidaan ohjata kasvusta tuotantoon fermentaation kuluessa repressoimalla kasvulle välttämättömiä aineenvaihdunnan entsyymejä. Säätelymekanismi muodostuu bakteereista peräisin olevasta ClpXP proteasomista, joka on indusoitavissa Tet-ON promoottorista. ClpXP proteasomi tunnistaa kohdeproteiinit ssrA sekvenssistä, ja ohjaa ssrA:lla merkityt proteiinit hajotettavaksi. SsrA sekvenssi lisättiin erikseen genomiin kolmeen kasvulle välttämättömään entsyymiin, jotka valittiin genomilaajuisen aineenvaihduntamallin simulaatioilla. Indusoimalla mikä tahansa näistä kolmesta entsyymistä hajotettavaksi hiivan kasvu saatiin pysähtymään. Kvantitatiivisen proteomiikan avulla todettiin, että kohde-entsyymien määrät laskivat spesifisesti niiden hajotuksen indusoinnin seurauksena. Viive indusoinnin ja kasvun pysähtymisen välillä riippui kohde-entsyymistä. Osoituksena aineenvaihdunnan aktiivisuudesta glukoosin tai etanolin kulutuksen havaittiin jatkuvan kasvun pysäyttämisen jälkeen, vaikka spesifiset kulutusnopeudet laskivat kasvuvaiheesta. Koska solujen aineenvaihdunta pysyi aktiivisena, todettiin, että synteettinen ClpXP säätelymekanismi tarjoaa yleistettävissä olevan ratkaisun teollisen kannattavuuden parantamiseen mikrobifermentaatioprosesseissa. Tulos on merkittävä, koska vain teollisesti kannattavat mikrobifermentaatiot mahdollistavat petrokemiallisten tuotantoprosessien korvaamisen ja siten ilmastonmuutoksen vastustamisen ja kestävän kehityksen edistämisen