Tulppavirtausreaktorin pystyttäminen hiivan ksyloosiaineenvaihdunnan tutkimiseksi

Metabolite concentrations that rapidly respond to changes in the cellular environment are a direct mirror of the physiological state of the cell. In the present work differences in the metabolism of two xylose utilizing yeast strains, a genetically modified Saccharomyces cerevisiae and wild-type Scheffersomyces stipitis, were studied using a bioreactor connected to a plug flow reactor prototype that can be used to study rapid reactions. Mode residence time distribution for the tubing line was determined and plug flow characteristics were evaluated. The Peclet number of the system was found to increase from about 60 to 320 for liquid flow rate of 1.98 mL min-1, ensuring plug flow characteristics. Constant flow of cultivation broth from an aerobic glucose/ethanol-limited chemostat was combined with the perturbation agent (1 g L-1 glucose, 5 g L-1 xylose, I g L-1 ethanol) or with water as a control. The mixture was introduced in the plug flow reactor where 9 samples were collected within a time window between 21 sand 2.5 min. The cell metabolism was halted using the cold methanol (100%) quenching technique and intracellular metabolites were extracted applying the boiling ethanol (75%) extraction method. Intracellular and extracellular metabolite concentrations and intracellular enzyme activities were measured. The most promising data were obtained from the S. cerevisiae cultivation in which glucose/ethanol-limited conditions were completely achieved. Especially the levels of intracellular metabolites (G6P, F6P and ATP) and PFK activity changed within the first minute of the pulse similarly to published results. For S. stipitis the chemostat conditions were not glucose/ethanol-limited, which probably prevented seeing responses within 2.5 minutes. However, this study showed that the performance of the plug flow reactor prototype is satisfactory and it is a versatile tool that can be used to study yeast metabolism and to facilitate elucidation of in vivo kinetics through various perturbation experiments.Aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet, jotka reagoivat nopeasti solun ulkopuolella tapahtuviin muutoksiin, kertovat suoraan solun fysiologisesta tilasta. Tässä työssä tutkittiin kahden ksyloosia hyödyntävän hiivakannan, geneettisesti muunnellun Saccharomyces cerevisiae:n ja villityyppi Scheffersomyces stipitis:n, aineenvaihdunnallisia eroja hyödyntäen bioreaktoriin kytkettyä tulppavirtausreaktorin prototyyppiä, jossa on mahdollista tutkia nopeita reaktioita. Tulppavirtausreaktorin letkustolle määritettiin reaktioaikojen jakauma sekä arvioitiin tulppavirtausominaisuuksia. Peclet-luvun todettiin kasvavan noin 60:stä 320:een nesteen virtausnopeudella 1.98 mL min-1 varmistaen tulppavirtausominaisuudet. Aerobisesta glukoosi/etanoli-rajoitteisesta kemostaatista johdettuun tasaiseen näytevirtaan yhdistettiin hiilenlähteitä (1 g L-1 glukoosia, 5 g L-1 ksyloosia, 1 g L-1 etanolia) sekä vesitausta pulsseina. Seos johdettiin tulppavirtausreaktoriin, josta otettiin 9 näytettä 21 s - 2.5 min välillä. Soluaineenvaihdunta pysäytettiin kylmällä 100 %:lla metanolilla ja solunsisäiset aineenvaihduntatuotteet uutettiin kiehuvalla 75 %:lla etanolilla. Otetuista näytteistä mitattiin solunsisäisten ja solunulkoisten aineenvaihduntatuotteiden pitoisuuksia sekä solunsisäisiä entsyymiaktiivisuuksia. Lupaavimmat tulokset saatiin S. cerevisiae kasvatuksesta, jossa glukoosi/etanoli-rajoittuneisuus saavutettiin täysin. Erityisesti solunsisäisten metaboliittien (G6P:n, F6P:n ja A TP:n) pitoisuudet sekä PFK:n aktiivisuus muuttuivat pulssin ensimmäisen minuutin aikana kirjallisuudessa esitettyjen arvojen mukaisesti. S. stipitis kasvatukset eivät olleet glukoosi/etanoli-rajoittuneita, mikä saattaa selittää, ettei 2.5 min aikana tutkituissa vasteissa havaittu muutoksia. Tämä tutkimus kuitenkin osoittaa, että tulppavirtausreaktorin prototyypin suorituskyky on riittävä ja se on monipuolinen työkalu hiivan aineenvaihdunnan ja in vivo kinetiikan tutkimiseen erilaisten pulssikokeiden avulla