Conception de nouveaux biocatalyseurs par fusion de domaines catalytiques

The biomicrobial production of molecules of interest can be improved by several engineering strategies. A metabolic pathway's efficiency depends principally on the enzymes inside the pathway. Indeed enzymatic engineering plays a central role in the conception of an efficient biomicrobial host. Gaining knowledge about the conception of synthetic enzymes and their characterization is essential. Inside a metabolic pathway, enzyme spatial colocalization might improve the bioproduction of a molecule of interest by allowing the rapid biotransformation of each metabolic intermediate of the pathway. Interestingly, multidomain proteins regrouping several enzymatic activities are described in the literature. Therefore, this work has focused in part on the conception of synthetic fusion enzymes for the production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. Different types and configurations of enzyme fusions were tested and were characterized. An efficient tripartite enzyme fusion producing two times fewer intermediates accumulation and two times more beta-carotene has been created. Precise quantification of each carotenoid's concentration coupled with enzymes quantification allowed the characterization of the efficiency of each of the synthetic enzymes. Besides fusion strategies, other ideas for the spatial co-localization of enzymes have also been tested using natural domain interaction like cohesin-dockerin or using natural oligomeric proteins like CcmK2. With those configurations, some carotenogenic enzymes were still functional. Some of those enzymatic systems modify carotenoids profiles in comparison with the natural system. Other constructions changed the metabolic flux of carotenoids inside the pathway. Fine control of the specific activity of each enzyme coupled with enzyme colocalization might allow better control of the nature of the produced carotenoid.La production de molécules d'intérêt par voie microbienne peut être améliorée par différentes stratégies d'ingénierie du vivant. L'ingénierie enzymatique joue un rôle central dans la conception d'organismes hôtes efficaces. En effet, l’efficacité de la voie dépend en premier lieu de celle des enzymes. Nous avons voulu apporter de nouvelles connaissances sur la conception d'enzymes synthétiques efficaces et sur les paramètres à tester pour leur caractérisation. Une colocalisation spatiale d'enzymes à l'intérieur de la voie métabolique pourrait améliorer la production de la molécule d'intérêt finale en permettant une biotransformation rapide des intermédiaires de la voie de biosynthèse. Dans la littérature, des protéines multidomaines regroupant plusieurs activités enzymatiques sont décrites. Nos travaux ont permis la création de fusions synthétiques d'enzymes caroténogéniques pour la production de bêta-carotène chez Saccharomyces cerevisiae. Différents types de fusions et de configurations enzymatiques ont été testés. Une fusion enzymatique tripartite efficace produisant deux fois moins d'intermédiaires et deux fois plus de bêta-carotène a été conçue. Les mesures précises de la concentration de chaque caroténoïde, associées à la quantification des enzymes, ont permis de caractériser l'efficacité de chaque enzyme synthétique. D'autres stratégies de colocalisation spatiale d'enzymes ont également été testées en utilisant des domaines d'interaction tels que la cohesine-dockérine ou la protéine oligomériques CcmK2. Certaines enzymes caroténogéniques préservent leur fonctionnalité au sein de ces configurations. Des systèmes enzymatiques construites modifient le flux métabolique des caroténoïdes et produisent des caroténoïdes différents de ceux des enzymes naturelles. Un contrôle plus affiné des activités enzymatiques pourrait permettre un contrôle précis de la nature des caroténoïdes produits