Development of multiplex Real-time PCR assays for screening of genetically modified organisms (GMOs).

TEZ9541Tez (Yüksek Lisans) -- Çukurova Üniversitesi, Adana, 2012.Kaynakça (s. 45-48) var.xi, 49 s. : res., tablo ; 29 cm.Ticari değeri olan genetiği değiştirilmiş organizmaların (GDO) sayısı ve bunları belirlemek için geliştirilen moleküler teknikler sürekli değişmektedir. Bunun sonucunda GDO laboratuvarları ve gıda üretim endüstrisi ham materyallerde ve kompleks işlenmiş gıda ürünlerinde güvenilir farklı yöntemleri uygulamaya zorlanmaktadır. Bu çalışmada GDO analizlerinde çoğunlukla kullanılan 35S (karnabahar mozaik virüs promotörü), NOS (Agrobacterium tumefaciens’in nopalin sentez geni terminatörü), FMV (Sıracaotu mozaik virüsünün 35S promotörü) ve Bar (Streptomyces hygroscopicus toprak bakterisi) genlerini belirlemek için çoklu realtime PCR sistemlerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bunlara ek olarak, PCR reaksiyonlarında engelleyici bir maddenin olup olmadığını kontrol edebilmek için dahili pozitif kontrol (IPC) ve bitki DNA’sının olup olmadığını belirlemek için bitki spesifik (18sR) probları kullanılmıştır. Real-time PCR reaksiyonlarında üç adet 35S, üç adet NOS, bir adet FMV ve 1 adet Bar genlerinin TaqManTM problarının kombinasyonları test edilmiştir. Sonuç olarak, ikili, üçlü ve dörtlü real-time PCR yöntemleri IPC ve 18sR genlerini içerecek şekilde geliştirilmiştir. Tüm kombinasyonlar hem Applied Biosystem (ABI 7500) hem de Strategene (Mx3005P) firmalarının Real-time PCR cihazlarında yapılmıştır. Geliştirilen yöntemlerin GDO laboratuvarlarında tarama için ucuz ve uygun olduğu bulunmuştur.The number of commerically available genetically modified organisms (GMOs) and molecular detection techniques have been constantly changing. As a result, GMO laboratories and the food production industry currently are forced to apply many different methods to reliably test raw material and complex processed food products. In this study, it was aimed to develop multiplex real-time PCR systems to detect 35S (the promoter of the cauliflower mosaic virüs), NOS (the terminator of the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens), FMV (the 35S promoter from the figwort mosaic virüs), and Bar (from the soilbacterium Streptomyces hygroscopicus) genes as the most widely used in GMO analysis. Additionally an internal positive control (IPC) indicating the presence or absence of PCR inhibiting substances, and plant gene specific primer (18sR) for the detection of plant gene was used in the PCR reactions. Combinations of three 35S, three NOS, one FMV and one Bar TaqManTM probes were tested in Real-time PCR reactions. As a result, duplex, triplex and quadruflex real-time PCR assays were developed including IPC and 18sR genes. All the combinations were performed in both Applied Biosystem (ABI 7500) and Stratagene (Mx3005P) Real-Time PCR systems. The developed methods were found to be inexpensive and suitable for fast screening in GMO labs.Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2012YL5