Mass spectrometry-based applications and analytical method development for metabolomics

Metabolites are small molecules present in a biological system that have multiple important biological functions. Changes in metabolite levels reflect genetic and environmental alterations and play a role in multiple diseases. Metabolomics is a discipline that aims to analyze all the small molecules in a biological system simultaneously. Since metabolites represent a diverse group of compounds with varying chemical and physical properties with a wide concentration range, metabolomic analysis is technically challenging. Due to its high sensitivity and selectivity, mass spectrometry coupled with chromatographic separation is the most commonly used analytical tool. Currently, there is no comprehensive universal analytical tool to detect all metabolites simultaneously and multiple methods are required. The aim of this study was to develop and apply mass spectrometry-based analytical methods for metabolomics studies. Neonatal rodents can fully regenerate their hearts after an injury. However, this regenerative capacity is lost within 7 days after birth. The molecular mechanism behind this phenomenon is unknown and understanding the biology behind this loss of regeneration capacity is necessary for the development of regeneration-inducing therapies. To investigate this mechanism, changes in mouse heart metabolite, protein, and transcript levels during the early postnatal period were studied. Non-targeted metabolomics methods utilizing liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry (GCxGC-MS) were applied to detect the metabolic changes of neonatal mouse hearts. Two complementary techniques increased metabolite coverage. A total of 151 identified metabolites showed differences in the neonatal period, reflecting changes in multiple metabolic pathways. The most significant changes observed in all levels (metabolite, protein, and transcript) were branched chain amino acid (BCAA) catabolism, fatty acid metabolism, and the mevalonate and ketogenesis pathways, thus revealing possible associations with regeneration capacity or regulation of the cardiomyocyte cell cycle. Insulin resistance (IR), metabolic syndrome, and type 2 diabetes have been shown to induce metabolic changes; the origin of the changes is unknown. In this study, human serum metabolite profiles from non-diabetic individuals were associated with IR. Gut microbiota were identified as a possible origin of the metabolic changes. Serum metabolites were detected with GCxGC-MS and lipids with LC-MS method. In total, 19 serum metabolite clusters were significantly associated with the IR phenotype, including 26 polar metabolites from five separate clusters and 367 lipids from 14 clusters. IR and changed metabolites were further associated with gut microbiota metagenomics and gut microbiota functional modules, showing that gut microbiota impacts the human serum metabolites associated with IR. Individuals with the IR phenotype had increased BCAA levels, which was influenced by bacterial species with increased BCAA biosynthesis potential and the absence of species with active bacterial inward BCAA transport. Sample throughput is often limited when chromatographic separation is used in metabolomics applications; a short analysis time is of great importance in large metabolic studies. The feasibility of direct infusion electrospray microchip MS (chip-MS) for global non-targeted metabolomics to detect metabolic differences between two cell types was studied and was compared to the more traditional LC-MS method. We observed that chip-MS was a rapid and simple method that allowed high sample throughput from small sample volumes. The chip-MS method was capable of separating cells based on their metabolic profiles and could detect changes of several metabolites. However, the selectivity of chip-MS was limited compared to LC-MS and chip-MS suffers more from ion suppression. Many biologically important low-abundance metabolites are not detectable with non-targeted metabolomics methods and separate more sensitive targeted methods are required. An in-house developed capillary photoionization (CPI) source was shown to have high ion transmission efficacy and high sensitivity towards non-polar compounds such as steroids. In this study, the CPI prototype was developed to increase its sensitivity. The feasibility of the ion source for the quantitative analysis of biological samples was studied by analyzing 18 endogenous steroids in urine with gas chromatography capillary photoionization tandem mass spectrometry (GC-CPI-MS/MS). The GC-CPI-MS/MS method showed good chromatographic resolution, acceptable linearity and repeatability, and low limits of detection (2-100 pg mL-1). In total, 15 steroids were quantified either as a free steroid or glucuronide conjugate from the human urine samples. Additionally, the applicability of the CPI interface for LC applications was explored for the first time using low flow rates. The feasibility of the LC-CPI-MS/MS for the quantitative analysis of four steroids was studied in terms of linearity, repeatability, and limits of detection. The method showed good quantitative performance and high sensitivity at a low femtomole level.Metaboliitit ovat molekyylipainoltaan pieniä aineenvaihduntatuotteita, joilla on merkittäviä biologisia tehtäviä elimistössä. Aineenvaihduntatuotteiden muutoksien on osoitettu liittyvän moniin sairauksiin, jonka takia niiden analysoiminen on tärkeää sairauksien diagnosoimiseksi, ennustamiseksi, sairausmekanismin selvittämiseksi, sekä lääkehoidon kehittämiseksi. Metabolomiikka pyrkii analysoimaan aineenvaihduntatuotteet samanaikaisesti biologisista näytteistä ja vertailemaan aineenvaihduntatuotteiden tasoja eri fysiologisten tilojen välillä ja sitä voidaankin hyödyntää useissa lääketieteellisen tutkimuksen eri vaiheissa. Aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet ja kemialliset ominaisuudet kuitenkin vaihtelevat merkittävästi, mikä tekee aineenvaihduntatuotteiden samanaikaisen analysoinnin haastavaksi. Tällä hetkellä ei ole olemassa yhtä kaikkien aineenvaihduntatuotteiden samanaikaiseen analyysiin soveltuvaa menetelmää. Parhaiten metaboliittien analyysiin soveltuu massaspektrometria, usein yhdistettynä kromatografisiin erotustekniikoihin, sen ylivoimaisen herkkyyden ja spesifisyyden vuoksi. Tässä työssä pyrittiin soveltamaan massaspektrometrisiä kohdentamattomia profilointimenetelmiä uuden biologisen tiedon tuottamiseksi muuttuneista aineenvaihduntatuotteista. Työssä pyrittiin myös kehittämään uusia herkempiä ja nopeampia massaspektrometrisiä menetelmiä metabolomiikkaan. Ensimmäisessä osatutkimuksessa kohdentamatonta metabolomiikkaa sovellettiin lääkehoidon kohdemolekyylin etsintään solujen uusiutumisen aktivoimiseksi massiivisia soluvaurioita aiheuttavien sairauksien hoidossa. Aineenvaihduntareiteissä tapahtuvia muutoksia tutkittiin hiirien sydämistä, jotka menettävät sydänsolujen uusiutumiskyvyn pian syntymän jälkeen. Metabolomiikalla havaittiin muutoksia useilla aineenvaihduntareiteillä syntymän jälkeisellä ajanjaksolla, jolloin sydänsolujen uusiutumiskapasiteetti heikkenee. Tuloksia yhdistettiin muiden biomolekyylien analyysituloksiin ja saatiin kattavaa tietoa syntymän jälkeisistä molekyylimuutoksista. Erityisesti ketogeneesi-aineenvaihduntareitin havaittiin vaikuttavan solujen jakautumiseen ja lisääntymiseen. Insuliiniresistenssin, metabolisen oireyhtymän ja tyypin 2 diabeteksen on osoitettu aiheuttavan metabolisia muutoksia ihmisissä, mutta muutosten syy on ollut tuntematon. Työn toisessa osatutkimuksessa tutkittiin suoliston mikrobiston yhteyttä insuliiniresistenssiin ja metabolisiin muutoksiin seerumissa. Tutkimuksessa havaittiin seerumin metaboliittien muutoksilla olevan yhteys insuliiniresistenssiin, sekä yksilöiden suolistomikrobeihin ja niiden toimintoihin. Insuliiniresistentillä ryhmällä havaittiin kohonneet haaroittuneiden aminohappojen pitoisuudet seerumissa, sekä enemmän bakteerilajeja, jotka syntetisoivat haaroittuneita aminohappoja. Tutkimus antoi viitteitä, että suolistomikrobeilla on yhteys insuliiniresistenssin ja tyypin 2 diabeteksen puhkeamiseen. Kolmannessa osatutkimuksessa tutkittiin suorasyöttömikrosirun soveltuvuutta kohdentamattomaan metaboliseen profilointiin vertailemalla menetelmää yleisesti käytettyyn nestekromatografia-massaspektrometria menetelmään solujen metaboliittien erojen havaitsemiseksi. Mikrosiru-menetelmän etuna on nopea alle minuutin analyysiaika, joka mahdollistaa ison näytemäärän analysoinnin lyhyessä ajassa pienestä näytemäärästä. Erot solujen metabolisten profiileiden välillä pystyttiin havaitsemaan molemmilla menetelmillä. Mikrosiru-menetelmän selektiivisyys oli kuitenkin heikompi ja ionien supressio massaspektrometrissa oli merkittävämpää. Neljännessä ja viidennessä osatutkimuksessa tutkittiin kapillaarifotoionisaatio ionisaatiotekniikan soveltuvuutta metabolomiikkaan. Kohdentamattomien profilointimenetelmien herkkyys ei riitä matalien pitoisuuksien analysointiin, jonka vuoksi myös kohdennettuja herkempiä menetelmiä tarvitaan tiettyjen yhdisteryhmien määrittämiseksi. Kapillaarifotoionisaation soveltuvuutta tutkittiin kehittämällä menetelmä steroidien määrittämiseksi virtsasta kaasukromatografia-massaspektrometrilla. Menetelmällä saavutettiin hyvä herkkyys ja menetelmän todettiin soveltuvan steroidien kvantitatiiviseen analytiikkaan biologisesta matriisista. Kapillaarifotoionisaation soveltuvuutta steroidien analysoimiseksi myös nestekromatografia-massaspektrometrialla tutkittiin ensimmäistä kertaa. Tutkimuksessa havaittiin kapillaarifotoionisaation soveltuvan myös nestekromatografiaan pienillä virtausnopeuksilla. Kohdentamattomalla metabolomiikalla saavutettiin merkittävää tietoa muuttuneista aineenvaihduntatuotteista ja havaittavien metaboliittien määrää laajennettiin käyttämällä kahta rinnakkaista menetelmää. Työssä kapillaarifotoionisaation ja mikrosirutekniikan osoitettiin soveltuvan käytettäväksi metabolomiikassa