Badania strukturalne i funkcjonalne wybranych enzymów z patogennych bakterii

Antybiotykooporność jest jednym z ważniejszych problemów zmaga się medycyna w ostatnich latach. Jako odpowiedź na niesprzyjające warunki środowiska, mikroorganizmy wykształciły zdolność do szybkiego przystosowywania się i rozprzestrzeniania nabytych cech pozwalających im przetrwać. Umiejętność ta sprawia, że znane antybiotykoterapie stają się coraz mniej skuteczne. Poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych stało się więc jednym z priorytetów badaczy na całym świecie. Głównym celem tej pracy było otrzymanie i scharakteryzowanie struktur przestrzennych białek pochodzących z patogennych bakterii, wyselekcjonowanych przez Centrum Genomiki Strukturalnej CSGID jako potencjalne cele nowych strategii terapeutycznych. Każde z tych białek na początkowym etapie krystalizacji poddano procedurze opracowanej w CSGID w celu usprawnienia i automatyzacji procesu otrzymania struktury przestrzennej, jednak we wszystkich przypadkach nie przyniosło to oczekiwanych efektów. Jednym z założeń tej pracy było więc opracowanie indywidualnej strategii eksperymentalnej dla każdego z badanych białek. Pierwszą grupę badanych białek stanowiły dihydroorotazy z bakterii Yersinia pestis (pałeczka dżumy) i Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery). Dihydroorotazy to enzymy szlaku syntezy pirymidyn de novo, którego prawidłowe funkcjonowanie jest niezbędne do przetrwania bakterii. Porównanie sekwencji i otrzymanych struktur z przedstawicielami innych poznanych już dihydroorotaz pozwoliło na klasyfikację nowo scharakteryzowanych enzymów jako bakteryjny typ II. Typ ten jest najbardziej odległy ewolucyjnie od ich ludzkiego odpowiednika, dzięki czemu różnice w ich budowie i sposobie działania mogą zostać wykorzystane do projektowania terapii ukierunkowanych na walkę z patogenami, minimalizując niekorzystny wpływ na działanie enzymu ludzkiego. Kolejnym badanym białkiem była peptydaza B z Yersinia pestis. Peptydazy B to metaloenzymy rozcinające wiązania peptydowe w wielu substratach. Otrzymano strukturę przestrzenną białka w formie nieaktywnej, które zawierało nieuporządkowany fragment łańcucha peptydowego w obrębie miejsca wiązania metalu. Otrzymany model przestrzenny białka został zdeponowany w bazie PDB jako pierwszy scharakteryzowany strukturalnie członek enzymów klasy EC 3.4.11.23. W celu scharakteryzowania enzymu w formie aktywnej, wygenerowano model homologiczny i porównano obie struktury. Kolejnym celem badań było otrzymanie struktury przestrzennej dla kasety wiążącej ATP, będącej częścią ABC transportera, wchodzącego w skład proteomu bakterii Coxiella burnetii. Transportery ABC wykorzystują energię z hydrolizy ATP do transportu przez błony. Ze względu na to uważane są za istotne czynniki wirulencji, ponieważ mogą transportować toksyny. Poza jonami magnezu, sodu i wapnia, a także cząsteczkami ATP związanymi przez białko, otrzymana struktura zawierała acetylowaną lizynę w pozycji 139. Acetylacja tej reszty była opisana w literaturze, natomiast nie zostało to wcześniej zaobserwowane w strukturach kaset wiążących ATP ABC transportera zdeponowanych w bazie PDB. Badania aldo-keto reduktazy z Klebsiella pneumoniae skupiały się na przybliżeniu funkcji fizjologicznej tego białka, ponieważ jego struktura przestrzenna została wcześniej określona. Aldo-keto reduktazy to białka o zróżnicowanej specyficzności substratowej, które używają NADPH jako kofaktora. W badaniach aktywności enzymatycznej przy użyciu skonstruowanej dla aldo-keto reduktaz biblioteki metabolitów wyłoniono substraty dla tego enzymu: izatynę oraz jej metylowaną i fenylowaną pochodną, benzaldehyd oraz jego pochodne, a także pirogronian sodu i jego pochodne. Informacje te mogą przyczynić się do odkrycia fizjologicznej funkcji tego białka a także ocenienia jego roli w procesie patogenezy. Ostatnim z badanych białek było hipotetyczne białko SAOUHSC_01256 z bakterii Staphylococcus aureus. Ponieważ żaden z otrzymanych kryształów nie rozpraszał promieniowania X dostatecznie, aby móc wyznaczyć strukturę przestrzenną, wygenerowano model homologiczny. Analiza wyników oraz porównanie z sekwencjami białek homologicznych wykazała że prawdopodobnie jest to członek nadrodziny białek podobnych do LuxS/M16 peptydaz. Otrzymane wyniki pozwoliły na uzyskanie trójwymiarowych modeli wybranych do badań białek a także przybliżenie funkcji tych enzymów, które wcześniej nie zostały scharakteryzowane. Znacząco zwiększa to dostępność modeli strukturalnych w bazie PDB i może przyczynić się do określenia struktury przestrzennej innych, homologicznych białek. Trójwymiarowe modele otrzymane w tej pracy mogą pomóc zrozumieć mechanizmy działania bakteryjnych enzymów a także określić ich rolę w patogenezie, a co za tym idzie przyczynić się do rozwoju nowych strategii terapeutycznych do walki z opornymi na antybiotykoterapię patogenami.Antimicrobial resistance is one of the most important problems of the recent years. As a response to environmental changes, microorganisms may quickly adapt and spread the resistance genes. Because of that, many antibiotics become less and less effective and new therapies are urgently needed. The aim of this study was to obtain and characterize the crystal structure of proteins originating from pathogenic bacteria, selected by Center for Structural Genomics of Infectious Diseases as a potential drug targets. Each of these proteins at the initial stage of crystallization was subjected to the procedure developed in CSGID in order to improve and automate the process of determining crystal structure, but in all cases it did not bring the expected results. One of the assumptions of this work was to develop an individual experimental strategy for each of the tested proteins. In the first group of investigated proteins were dihydroorotases from Yersinia pestis and Vibrio cholerae. Dihydroorotases are enzymes of de novo pyrimidine biosynthesis pathway and their proper functioning is essential for pathogen survival. The comparison of obtained structures and amino acid sequences with the representatives of other dihydroorotases allowed to classify them as bacterial type II. This type is the most evolutionary distant from the human dihydroorotase. The differences in the structure and function of bacterial and human dihydroorotases may be used for designing the effective therapies that eliminate pathogens and in the same time have the minimal adverse effect of the host. The next tested protein was peptidase B from Y. pestis. Peptidases B are metalloenzymes cleaving peptide bonds in many substrates. The crystal structure of the protein in inactive form, which contained a disordered fragment of the peptide chain within the metal binding site was obtained. In order to characterize the enzyme in an active form, a homologous model was generated and both structures were compared. The crystal structure of the protein was deposited in the PDB database as the first structurally characterized member of EC 3.4.11.23 enzymes. The next part of the investigation was to obtain a structure of the ATP binding cassette, which is part of the ABC transporter from Coxiella burnetii. ABC transporters use energy from ATP hydrolysis for transport through membranes. Because of this, they are considered to be important virulence factors due to their ability to transport toxins. In addition to the magnesium, sodium and calcium ions as well as ATP molecules bound by the protein, the obtained structure contained acetylated lysine at position 139. Acetylation of this residue was described in the literature, while this was not previously observed in the structures of ATP ABC transporter cassettes deposited in the PDB database. Because the crystal structure of aldo-keto reductase from Klebsiella pneumoniae was previously determined, this study focused on the approximation of the physiological function of this protein. Aldo-keto reductases are proteins with a broad substrate specificity that use NADPH as a cofactor. In the enzymatic tests with the metabolite library constructed for the aldo-keto reductases, substrates for this enzyme were identified: isatin and its methyl and phenyl derivatives, benzaldehyde and its derivatives, as well as sodium pyruvate and its derivatives. This information may contribute to the discovery of the physiological function of this protein as well as the evaluation of its role in the pathogenesis. The last of the tested proteins was the hypothetical protein SAOUHSC_01256 from Staphylococcus aureus. Since none of the obtained crystals diffracted the X-rays in sufficient way to determine the structure, a homology model was generated. Analysis of the results and comparison with the homologous sequences showed that this protein may belong to LuxS/M16 peptidase-like superfamily. The obtained results allowed to obtain three-dimensional models for proteins selected for this research and to approximate the function of those that have not been characterized before. This significantly increases the availability of structural models in the PDB database and may contribute to determining the crystal structure of other, homologous proteins. Three-dimensional models obtained in this work can help to understand the mechanisms of reactions catalyzed by bacterial enzymes and determine their role in pathogenesis, and thus contribute to the development of new therapeutic strategies to fight antibiotic-resistant pathogens