Interakcja taliny i integryny $\beta1$ w procesie ruchliwości komórek nowotworowych

Choroby nowotworowe są drugą, po chorobach układu krążenia, najczęstszą przyczyną zgonów na świecie. Chociaż łagodne zmiany nowotworowe cechują się wysoką przeżywalnością, złośliwe guzy często powiązane są z wysoką śmiertelnością pacjentów. Przedstawiona rozprawa koncentruje się badaniu jak oddziaływanie taliny z integryną $\beta1$ (białek związanych z adhezją, powiązanych również z migracją komórek oraz rozwojem nowotworów) wpływa na ruchliwość komórek nowotworowych, a w szczególności na ich adhezję, pozycjonowanie oraz inwazyjność. Na potrzeby zaprezentowanych badań opracowano oprogramowanie umożliwiające dekonwolucję wielu obrazów mikroskopowych (Publikacja I); BatchDeconvolution to wtyczka do programu Fiji, która łączy ze sobą moduły PSF Generator oraz DeconvolutionLab2 (BIG, EPFL), programy służące odpowiednio do wyznaczania Funkcji Rozmycia Punktu (ang. Point Spread Function, PSF) oraz dekonwolucji obrazów. BatchDeconvolution rozszerza w ten sposób funkcjonalność powyższego oprogramowania, zapewniając środowisko umożliwiające sekwencyjne, zautomatyzowane wyostrzenie wielopozycyjnych, wielokanałowych, poklatkowych plików graficznych. Takie podejście pozwoliło na przetworzenie dużej ilości obrazów mikroskopowych zebranych podczas badań in vitro przedstawionych w dalszych częściach pracy. Istnieją dwie izoformy białka taliny: talina1 i talina2. Talina1 jest szeroko badana, natomiast niewiele wiadomo o biologicznej roli taliny2. Mimo tego, że posiada ona wiele funkcji wspólnych z jej siostrzanym białkiem, jednak literatura wskazuje, że białka te wykazują swoistą aktywność w komórkach i nie są względem siebie redundantne. Zaprezentowane badania skupiają się na mechanizmie molekularnym, za pomocą którego swoiście talina2 reguluje sekrecję i transport wewnątrzkomórkowy metalopeptydazy macierzowej 9 (MMP9), enzymu biorącego udział w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej i dojrzewania inwadopodiów w początkowych stadiach inwazji nowotworowej. Badania prowadzono na linii komórkowej raka piersi. Usunięcie taliny2 z komórek spowodowało zahamowanie dokowania pęcherzyków z MMP9 do błony podstawnej, a w konsekwencji skierowanie ich do degradacji w lizosomach. Co więcej, mutacja reszty aminokwasowej w talinie2 odpowiedzialnej za charakter oddziaływania talina2-integryna $\beta1$, dała podobne wyniki jak ablacja taliny2. Ze względu na wzmożony recykling MMP9, komórki pozbawione taliny2 zaczęły gromadzić metalopeptydazę w przerośniętych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, co sugeruje przekroczenie maksymalnej wydajności procesu degradacji białek w komórce (Publikacja II). Interakcja taliny z integryną $\beta1$ odgrywa rolę również w tworzeniu się guzów i adhezji nowotworów jelita grubego. Publikacja III, zawarta w tej rozprawie, opisuje rolę cyjanidyno-3-O-glukozydu (C3G) w kontekście regulacji oddziaływania taliny1 i taliny2 z integryną $\beta1$, procesu nowotworzenia oraz adhezji komórek raka jelita grubego. C3G jest naturalnym barwnikiem występującym w wielu czerwonych i niebieskich warzywach i owocach. Wykazuje on wiele korzystnych dla zdrowia właściwości, m.in. przeciwutleniające, przeciwzapalne czy przeciwcukrzycowe. Ponadto, kilka doniesień łączy C3G z działaniem przeciwnowotworowym. Z badań przedstawionych w niniejszej pracy wynika, że na granicy białek w kompleksie taliny i integryny tworzy się kieszeń wiążąca dla C3G. Obecność tego związku zwiększa powinowactwo między tymi białkami, prowadząc do zwiększenia adhezji w komórkach raka jelita grubego, co skutkuje w zahamowanie powstawania guzów. Poszerzenie wiedzy na temat funkcji białek taliny1 i taliny2 umożliwia lepsze zrozumienie regulacji procesu powstawania i przerzutowania nowotworów. Co więcej, mimo że talina2 została odkryta ponad 20 lat temu, jej rola w biologii i adhezji komórek jest nadal słabo zbadana. Przedstawione badania pozwalają poszerzyć naszą wiedzę na ten temat. Ponadto, poznanie mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za interakcję białek biorących udział w rozwoju nowotworów może pomóc w opracowywaniu nowych terapii przeciwnowotworowych.Cancer is the second most common cause of death after cardiovascular diseases. Although benign tumors have very high survival rate, cancer malignancy strongly increases mortality. The presented thesis concentrates on the interplay between talin and $\beta1$ integrin (adhesion related proteins, also strongly connected with cell migration and cancer development) in mediation of cancer cells physiology and motility, especially in regulating cell adhesion, positioning, and invasion. For the purpose of the study, software capable to deconvolve multiple microscopy images in a single session was developed (Publication I); BatchDeconvolution is a Fiji plugin that bridges PSF Generator and DeconvolutionLab2 (BIG, EPFL), programs serving for calculations of the Point Spread Function and performing image deconvolution, respectively. BatchDeconvolution expands functionalities of these software, providing an environment that allows to enhance multi-position, multi-channel time-lapse image files in a sequential, automated manner. This approach allowed to process a vast amount of microscopy images collected during in vitro studies presented in the following sections. There are two isoforms of talin protein: talin1 and talin2. While talin1 has been extensively studied, there is still not much known about the biological role of talin2. It shares some functions with its sister variant, but the literature describes only a limited redundancy. The presented study concentrates on the molecular mechanism by which specifically talin2 mediates secretion and trafficking of matrix metallopeptidase 9 (MMP9), an enzyme important for extracellular matrix degradation and invadopodia maturation in initial stages of cancer invasion. The study was conducted in MDA-MB-231breast cancer cell line. The absence of talin2 caused inhibition of a process of MMP9 vesicles docking to the ventral membrane, consequently rerouting them towards lysosomal degradation. Furthermore, S339C mutation of talin2, specific for reducing talin2-$\beta1$ integrin interaction, gave similar results as the ablation of talin2. Due to a higher recycling rate, talin2-depleted cells started to exhibit enlarged vesicles containing MMP9, what suggests an overflow of the protein degradation process (Publication II). Talin-$\beta1$ integrin interaction is also a factor in colon cancer tumorigenesis and colon cancer cells adhesion. In Publication III, included in the thesis, a role of cyanidino-3-Oglucoside (C3G) was examined in the context of mediating talin1- and talin2-$\beta1$ integrin interaction, tumor development, and colon cancer cells adhesion. C3G is a natural dye found in many red and blue vegetables and fruits. It shows many health beneficial properties including anti-oxidative, anti-inflammation, and anti-diabetic ones. Moreover, several reports connect it with an anti-carcinogenic activity. The presented study shows that the C3G binding pocket is located at the interface between talin and integrin. The presence of the compound increases affinity between the two proteins, leading to stimulation of colon cancer cells adhesion. In result, it hinders tumorigenesis. The new knowledge of the functions of talin1 and talin2 proteins allows a better understanding of the regulation of cancer metastasis. Furthermore, even though talin2 was discovered over 20 years ago, its role in cell biology and adhesion is still understudied. The presented research sheds some light on that aspect. Finally, the description of molecular mechanisms driving protein interactions in cancer development may help in designing new anti-cancer therapies