Screening for broad-spectrum β-lactamasecontaining bacteria (ESBL and carbapenemases) in environmental samples by using molecular and phylogenetic investigation methods

Background: The increase in antibiotic resistant bacteria is a major global threat against public health. Especially concerning is the elevated prevalence of multidrug resistance among clinically significant bacteria, such as extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Gram-negatives in the Enterobacteriaceae family. These bacteria are resistant against some of the most important antibiotics globally; the β-lactams. Much of the knowledge on antibiotic resistance is based on studies of clinical samples. To achieve a comprehensive understanding of antibiotic resistance, it is considered necessary to focus more on research targeting natural environments such as soil. Purpose: The main goals of this master thesis were (i) to search for ESBL-holding bacteria in soil, (ii) to determine the bacterial genera being resistant to β-lactam antibiotics, including car-bapenem and (iii) to search for possible resistance mechanisms related to the occurrence of ESBL-genes in bacterial samples with ESBL-phenotypic resistance. Method: Selective chromogenic media was used to grow and differentiate bacteria with the ESBL-phenotype. The identity of the isolates was then determined with 16S rRNA Sanger-se-quencing method. A possible ESBL-genotype was established by screening for some of the most prevalent ESBLA- and ESBLKARBA-genes, using Multiplex PCR and agarose gel electrophoresis. Nanopore-sequencing technology was used to verify any such findings. The study of microbial diversity was based on 16S rRNA sequencing with Illumina MiSeq, of DNA extracted directly from soil samples. Results: Selective growth indicated the presence of 16 multidrug resistant bacterial isolates with ESBL-phenotype, including some with ESBLKARBA-phenotypical resistance. Seven of the re-sistant isolates were identified either as Pseudomonas spp. (n=2), Bordetella spp. (n=3) or Serra-tia spp. (n=2). Based on Multiplex PCR, three of these seven isolates were shown to have ESBL-type genes. Isolates of Pseudomonas spp. and Bordetella spp. contained the ESBLA-gene blaSHV, while one of the isolate of Serratia spp. contained the ESBL-genes blaKPC and blaTEM. Some of these findings became verified with whole-genome sequencing. The microbial diversity study in-dicated that the samples from Niagara had a somewhat higher prevalence of Pseudomonas spp., while it was no indication of any domination of a certain bacterial species in the soil samples form Veterinærjordet (nord). Conclusion: In this study ESBL-producing Gram-negative bacteria related to clinical significant species, were found in randomly selected soil samples. These findings emphasize the importance of exploring the environmental soil bacteria, as they are possible reservoirs of antibiotic resistance genes and other resistance mechanisms.Bakgrunn: Antibiotikaresistens er et økende globalt helseproblem. Særlig alvorlig er økt fore-komst og spredning av multiresistens blant klinisk relevante bakterier, som ESBL-produserende Gram-negative bakterier i familien Enterobacteriaceae. Disse bakteriene er resistente mot noen av de viktigste og mest brukte antibiotika på verdensbasis, nemlig β-laktamantibiotika. Kunnskap om antibiotikaresistens er ofte basert på studier av kliniske isolater. For å oppnå en mer helhetlig forståelse av antibiotikaresistens bør forskingen rettes mer mot naturlige miljø, som jord. Hensikt: Hovedmålene med denne masteroppgaven var (i) å screene etter ESBL-holdige bakterier i jord, (ii) å bestemme slektskapet til isolat med bredspektret resistens mot β-laktamantibiotika, inkludert karbapenem og (iii) å kartlegge mulige resistensmekanismer knyttet til tilstedeværelse av ESBL-gener i bakterieisolat med ESBL-fenotypisk resistens. Metode: Det ble brukt selektiv kromogen agar både for å dyrke frem bakterier med ESBL-feno-typisk resistens, i tillegg til å differensiere mellom bakterier basert på kolonifarge. Sanger-sekven-sering av 16S rRNA ble brukt som metode for å verifisere og å fastslå identiteten til bakte-rier med ESBL-fenotypisk resistens fra selektiv kromogen agar. For å screene etter ESBL-gener i jordbakterier ble det brukt Multiplex PCR med primerpar tilpasset påvisning av de mest utbredte ESBLA- og ESBLKARBA-genene. Agarose gelelektroforese ble brukt for å synliggjøre eventuelle funn. Resultater fra Nanopore-sekvensering ble brukt for å bekrefte funn fra Multiplex PCR og Sanger-sekvensering. For å kartlegge den mikrobielle diversiteten i prøvene ble DNA ekstrahert direkte fra jord, og 16S rRNA fra DNA-templat ble sekvensert med Illumina MiSeq. Resultater: Med selektiv oppdyrking ble det isolert totalt 16 multiresistente bakterier med ESBL-fenotypisk resistens, inkludert bakterier med ESBLKARBA-fenotypisk resistens. Syv av disse isola-tene ble identifisert enten som Pseudomonas spp. (n=2), Bordetella spp. (n=3) eller Serratia spp. (n=2). Totalt tre av de syv isolatene var ESBL-holdige ifølge Multiplex PCR. I Pseudomonas spp. og Bordetella spp. ble ESBLA-genet blaSHV påvist, og i Serratia spp. ble ESBL-genene blaKPC og blaTEM påvist. Med helgenomsekvensering ble noen av disse funnene bekreftet. Mikrobiotase-kvensering indikerte en relativt stor forekomst av Pseudomonas spp. i prøver fra Niagara, mens det i Veterinærjordet (nord) var jevnere forekomster av bakterier. Konklusjon: Denne studien påviste tilstedeværelsen av ESBL-produserende Gram-negative bak-terier i jord, med slektskap til klinisk signifikante bakterier. Funnene kan brukes som utgangs-punkt for videre forskning ettersom de understreker behovet for økt fokus på studier rettet mot resistens i miljøet, inkludert jordbakterier som mulige reservoarer for antibiotikaresistens og an-tibiotikaresistente gener.submittedVersionM-MA