Screening for bacteria containing broad-spectrum β-lactamases (ESBL and carbapenemases) in aquatic environment by using molecular and phylogenetic investigation methods

Antibiotikaresistens er en naturlig adaptiv prosess som har eksistert i miljøet i årtusener, men resistens kan ha blitt akselerert som følge av økt bruk og forekomst av antibakterielle midler i miljøet, og som følge av medisinsk og landbruksbasert etterspørsel. På grunn av fare for zoonotiske sykdommer er det viktig med økt kunnskap om utbredelse og effekten av antibiotikaresistente patogener i miljøet. Hensikten med denne oppgaven har vært (i) å undersøke eventuell tilstedeværelse av MRSA og ESBL produserende bakterier i vannprøver fra akvatisk miljø ved NMBU. (ii) Slektskapet til isolater av disse skulle bestemmes ved fenotypiske og genotypiske metoder, samt (iii) mulige resistensmekanismer for disse isolatene. Dette er antibiotikaresistente bakterier av klinisk relevans, og eventuelt funn av disse vil kunne bidra til økt kunnskap om bakterienes opprinnelse, og om hvordan disse resistens-genene kan spre seg i miljøet. Prøver ble dyrket på ESBL, CRE og MRSA selektive kromogene medier for screening etter bakterier med disse fenotyper. Isolerte prøver ble identifisert ved å benytte 16S rRNA Sanger sekvensering. For å identifisere mulige genotyper fra isolatene ble disse analysert ved å kjøre PCR-multiplexer på noen av de mest utbredte ESBLA- og ESBLAKARBA- og MRSA-gener. Sanger-sekvensering ble kjørt for verifisering av positive prøver. Resultatene viste tilstedeværelse av antibiotikaresistensgener i vannprøver fra nærmiljøet. Av totalt 12 rendyrkede vannprøver med vekst, ble ti prøver analysert i denne forskningsoppgaven. I tillegg ble det utført analyser på fire DNA-isolater fra jordprøver isolert av masterstudenter året før. Ved å benytte PCR ble resistensgener fra genfamiliene TEM og CMY-2 påvist i to av vannprøvene, mens VIM gener ble påvist i en av jordprøve. Tilstedeværelse av disse genene ble bekreftet ved Sanger sekvensering. Ved å kjøre 16S rRNA og Sanger sekvensering, ble det isolatene funnet å være Pseudomonas spp. og Escherichia coli eller Shigella flexneri, bakterier som er typisk å finne i akvatisk miljø. Det kan konkluderes med at: (i) det ble detektert antibiotikaresistens bakterier i vann- og jordprøvene, (ii) slektskapet til isolatene stammet fra bakterier som er vanlige i fuktig miljø og forurenset vann, (iii) ESBL- og CAR- resistensgenene VIM, TEM og CMY-2 som ble funnet, er assosiert med mobile genetiske elementer, noe som gjør at de kan overføres horisontalt til andre bakterier. Medlemmer av Enterobacteriaceae og Pseudomonadaceae-familiene inkluderer flere human-patogener som kan infisere gjennom forurenset mat og vann. Tilstedeværelsen av VIM, TEM og CMY gener som er assosiert med mobile genetiske elementer, og dermed kan overføres horisontalt til andre bakterier, kan i enkelte tilfeller gjøre humanpatogene bakterier multiresistente. At blaTEM og blaCMY-2 bærende bakterier av disse familiene finnes i akvatisk miljø i et område med stort potensial for utveksling av bakterier mellom mennesker og dyr er bekymringsfullt.Antibiotic resistance is a naturally adaptive process which has existed for billions of years. This resistance may have been accelerated by increased occurrence and use of antibacterial agents in the environment due to medical and agricultural demand. An increased knowledge about the spread of antibiotic-resistant pathogens in the environment is important due to the risk of zoonotic diseases. The purpose of this research has been to (i) investigate the presence of MRSA and ESBL producing bacteria in water samples from a little stream at NMBU Campus. (ii) to determine the bacterial genera of these bacteria, and (iii) to search for possible mechanisms of resistance for these isolates. These are antibiotic resistant bacteria of clinical relevance, and any findings may contribute to increased knowledge of the origin of the bacteria and how these resistance genes can spread in the environment. Samples were grown on ESBL, CRE and MRSA selective chromogenic media for differentiation of bacteria with these phenotypes. The identities of the different isolates were then determined using 16S rRNA Sanger-sequencing method. To establish possible genotypes from the isolates, they were screened by running PCR containing some of the most prevalent ESBLA- and ESBLAKARBA- and MRSA- genes. Sanger-sequencing was run for verification of positive samples. The results showed the presence of antibiotic resistance genes in the water samples at NMBU Campus. Of a total of 12 rendered water samples with growth, ten samples were analyzed in this research assignment. In addition, analyzes were performed on four DNA isolates from soil samples isolated by master students the previous year. Analyzing the samples by using PCR, resistance genes from the gene families TEM and CMY-2 were detected in two of the water samples, while VIM genes were detected in one of the soil samples. The presence of these genes was confirmed by Sanger sequencing. By running 16S rRNA and Sanger sequencing, the isolates were found to be Pseudomonas spp. And Escherichia coli or Shigella flexneri, bacteria that are typically found in aquatic environments. From the information obtained in this study, it can be concluded that: (i) antibiotic resistance bacteria were detected in the water and soil samples from the NMBU Campus, (ii) the isolated bacteria are commonly found in humid environment and contaminated water, (iii) the ESBL and CAR resistance genes VIM, TEM and CMY-2 found in this study are associated with mobile genetic elements, which allows them to be transmitted horizontally to other bacteria. Members of the Enterobacteriaceae and Pseudomonadaceae families include several human pathogens that may cause infections through contaminated food and water. The presence of VIM, TEM and CMY genes associated with mobile genetic elements, may be transferred horizontally to other bacteria. This may, in some cases, render human pathogenic bacteria multi resistant. The fact that blaVIM, blaTEM and blaCMY-2 carrying bacteria belonging to these families exist in an aquatic environment with great potential for the exchange of bacteria between humans and animals is worrying.submittedVersionM-MA