Meme Kanseri Tedavisinde Aktif Hedeflendirme Amacıyla Kullanılmak Üzere Nano Boyutlu İlaç Taşıyıcı Sistemlerin (Nanofarmasötikler) Tasarımı, İn Vitro/İn Vivo Değerlendirilmesi

The aim of an ideal therapy using anticancer molecules is to target tumors selectively without damaging healthy tissues. Tumor specific markers formed by the physiological and morphological changes during the growth of cancer cells are identified by the help of specific ligands. The aim of active targeting, which is developed in this direction, is to protect the normal tissues from the therapy. The lymphatic system plays a critical role in the metastasis of cancer cells, thus lymphatic targeting approach has gained importance for the prevention of cancer metastasis. Laakkonen et al. have identified a cyclic 9-amino-acid (CGNKRTRGC) peptide called LyP-1, which specifically binds to tumor lymphatic vessels using phage-displayed peptide libraries in 2002. Within the scope of this thesis, LyP-1 containing lipid-based nanopharmaceutics (self emulsifying drug delivery systems, SEDDS) were targeted to p32, which is found in high amounts on the surface of breast cancer cells and to which LyP-1 binds and is internalized. Furthermore, the conjugates of the peptide were prepared with doxorubicin hydrochloride, anti-DTPA antibody and fluorescein. The characterization studies were carried out for all prepared formulations. Caco-2, MDA-MB-231 and 4T1 cell lines were used for in vitro evaluation of SEDDS formulations (liquid and solid), as well as in vivo efficacy studies were performed in 4T1 mouse breast cancer model in accordance with the results obtained from in vitro studies. At the end of this thesis, SEDDS formulations of LyP-1 for parenteral and oral use were developed and their potential for the treatment of breast cancer by lymphatic targeting were shown.Bu tez, TÜBİTAK SBAG 1002(Proje Numarası: 113S569), TÜBİTAK 2214/A, HÜBAB Hızlı Destek (Proje Numarası: THD-2017-11642) ve HÜBAB Lisansüstü Tez Desteği Projesi (Proje Numarası: TDK-2017-15964) kapsamında desteklenmiştir.ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN SAYFASI v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER ve KISALTMALAR xiv ŞEKİLLER xvi TABLOLAR xxi 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Kanser ve Kanser Tedavisinde Güncel Yaklaşımlar 3 2.2. Kanser Tedavisinde Tümöre Hedeflendirme 4 2.2.1. Tümöre Hedeflendirilmiş Peptitler 8 2.2.2. LyP-1 ve Aktif Hedeflendirme 10 2.3. Lenfatik Sistem ve Kanserdeki Rolü 17 2.3.1. Kanser Tedavisinde Lenfatik Hedeflendirme Yaklaşımları 18 2.4. Nano Boyutlu İlaç Taşıyıcı Sistemler ve Kanser Tedavisindeki Yeri 20 2.5. Peptit Konjugatları 22 2.5.1. Peptit – İlaç Konjugatları 23 2.6. Antikor Konjugatları 25 2.6.1. Bispesifik Hedeflendirme 27 2.7. Yağ Bazlı İlaç Taşıyıcı Sistemler 28 2.7.1. Kendiliğinden Emülsifiye Olabilen İlaç Taşıyıcı Sistemler 31 (SEDDS) 2.7.2. SEDDS Oluşum Mekanizmaları 33 2.7.3. SEDDS Türleri 34 2.8. SEDDS Formülasyonlarının Hazırlanması ve Hazırlamada Kullanılan 36 Yardımcı Maddeler ix 2.8.1. Yağlar 36 2.8.2. Yüzey Etkin Maddeler / Yardımcı Yüzey Etkin Maddeler 38 2.8.3. Yardımcı Çözücüler 40 2.9. SEDDS Formülasyonlarında Güncel Yaklaşımlar 41 3. GEREÇ VE YÖNTEM 47 3.1. Kullanılan Kimyasal Madde, Malzeme ve Aletler 47 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler 47 3.1.2. Kullanılan Aletler 48 3.2. Önformülasyon Çalışmaları 50 3.2.1. Yardımcı Maddelerin Seçimi 50 3.2.2. Üçgen Faz Diyagramları 50 3.2.3. Sıvı Formülasyonların Hazırlanması 55 3.2.4. Katı Formülasyonların Hazırlanması 56 3.3. Formülasyon Optimizasyonu ve Karakterizasyonu 59 3.3.1. Makroskobik Özellikler 59 3.3.2. Mikroskobik Özellikler 59 3.3.3. Damlacık Büyüklüğü ve Zeta Potansiyel Tayini 59 3.3.4. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Analizi 60 3.4. Konjugasyon Çalışmaları 60 3.4.1. Peptit – İlaç Konjugatlarının Hazırlanması 60 3.4.2. Polimer – İlaç Konjugatlarının Hazırlanması 61 3.4.3. Bispesifik Konjugatların Hazırlanması 63 3.5. Konjugatların Karakterizasyonu 66 3.5.1. D-PGA Konjugatlarının Tayini için ELISA Testi 66 3.5.2. Modifiye Edilmiş anti-DTPA’nın İmmunoreaktivite Tayini 66 3.5.3. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS- 67 PAGE) 3.5.4. Floresan Aktive Hücre Ayırma (Fluorescence Activated Cell 67 Sorting, FACS) Analizi 3.5.5. In – Cell ELISA 68 3.5.6. İmmünositokimya Çalışmaları 68 3.6. Etkin Madde Miktar Tayin Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu 69 x 3.6.1. HPLC Yönteminin Geliştirilmesi ve Validasyonu 69 3.6.2. LC-MS/MS Yönteminin Geliştirilmesi 73 3.7. Stabilite Çalışmaları 74 3.7.1. Etkin Maddenin Stabilitesi 74 3.7.2. Formülasyonların Stabilitesi 77 3.8. Dissolüsyon Çalışması 77 3.9. Hücre Kültürü Çalışmaları 78 3.9.1. 3.9.2. 3.9.3. 3.9.4. 3.10. İn Vivo 3.10.1. 3.11. İn Vivo Formülasyonlara Ait Çalışmalar 79 Konjugatlara Ait Çalışmalar 83 Western Blot Analizi 84 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 86 Etkililik Çalışmaları 89 Tümör Modeline Karar Verilmesi 90 Biyodağılım Çalışması 91 3.12. Bulguların İstatistiksel Olarak Değerlendirilmesi 92 4. BULGULAR 93 4.1. Önformülasyon Çalışmaları 93 4.1.1. Makroskobik Özellikler 93 4.1.2. Mikroskobik Özellikler 94 4.1.3. Damlacık Büyüklüğü ve Zeta Potansiyel Tayini 94 4.2. Formülasyon Çalışmaları 97 4.2.1. Üçgen Faz Diyagramları 97 4.3. Formülasyonların Karakterizasyonu 99 4.3.1. Makroskobik Özellikler 99 4.3.2. Mikroskobik Özellikler 99 4.3.3. Damlacık Büyüklüğü ve Zeta Potansiyel Tayini 99 4.3.4. Katı Formülasyonların Karakterizasyonu 100 4.3.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Analizi 104 4.4. Konjugasyon Çalışmaları 105 4.4.1. Peptit – İlaç Konjugatlarının Hazırlanması 105 4.4.2. Polimer – İlaç Konjugatlarının Hazırlanması 106 4.5. Konjugatların Karakterizasyonu 108 xi 4.5.1. D-PGA Konjugatlarının Tayini için ELISA Testi 108 4.5.2. Modifiye Edilmiş anti-DTPA’nın İmmunoreaktivite Tayini 109 4.5.3. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS- 110 PAGE) 4.5.4. Floresan Aktive Hücre Ayırma (Fluorescence Activated Cell 112 Sorting, FACS) Analizi 4.5.5. In – Cell ELISA 112 4.5.6. İmmünositokimya Çalışmaları 114 4.6. Etkin Madde Miktar Tayin Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu 119 4.6.1. HPLC Yönteminin Geliştirilmesi ve Validasyonu 119 4.6.2. LC-MS/MS Yönteminin Geliştirilmesi 123 4.7. Stabilite Çalışmaları 125 4.7.1. Etkin Maddenin Stabilitesi 125 4.7.2. Formülasyonların Stabilitesi 131 4.8. Dissolüsyon Çalışması 132 4.9. Hücre Kültürü Çalışmaları 134 4.9.1. 4.9.2. 4.9.3. 4.9.4. 5.1.1. Makroskobik Özellikler 171 5.1.2. Mikroskobik Özellikler 172 5.1.3. Damlacık Büyüklüğü ve Zeta Potansiyel Tayini 172 5.2. Formülasyon Çalışmaları 173 5.2.1. Üçgen Faz Diyagramları 173 5.3. Formülasyonların Karakterizasyonu 174 5.3.1. Katı Formülasyonların Karakterizasyonu 175 5.3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Analizi 176 Formülasyonlara Ait Çalışmalar 134 Konjugatlara Ait Çalışmalar 155 Western Blot Analizi 156 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 157 Etkililik Çalışmaları 158 Biyodağılım Çalışması 163 4.10. İn Vivo 4.11. İn Vivo 5. TARTIŞMA 5.1. Önformülasyon Çalışmaları 171 171 xii 5.4. Konjugasyon Çalışmaları 177 5.4.1. Peptit – İlaç Konjugatlarının Hazırlanması 177 5.4.2. Polimer – İlaç Konjugatlarının Hazırlanması 179 5.5. Konjugatların Karakterizasyonu 180 5.5.1. D-PGA Konjugatlarının Tayini için ELISA Testi 180 5.5.2. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS- 179 PAGE) 5.5.3. Floresan Aktive Hücre Ayırma (Fluorescence Activated Cell 181 Sorting, FACS) 5.5.4. In – Cell ELISA 181 5.5.5. İmmünositokimya Çalışmaları 182 5.6. Etkin Madde Miktar Tayin Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu 184 5.6.1. HPLC Yönteminin Geliştirilmesi ve Validasyonu 184 5.6.2. LC-MS/MS Yönteminin Geliştirilmesi 185 5.7. Stabilite Çalışmaları 185 5.8. Dissolüsyon Çalışması 187 5.9. Hücre Kültürü Çalışmaları 188 5.9.1. Formülasyonlara Ait Çalışmalar 188 5.9.2. Konjugatlara Ait Çalışmalar 193 5.9.3. Western Blot Analizi 194 5.9.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 195 5.10. İn Vivo Etkinlilik Çalışmaları 196 5.11. İn Vivo Biyodağılım Çalışması 198 6. SONUÇ ve ÖNERİLER 200 7. KAYNAKLAR 202 8. EKLER 222 EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzni EK-2: Tez Çalışması ile İlgili Bildiriler ve Yayınlar 9. ÖZGEÇMİŞ 228Antikanser özellikte etkin maddeler kullanılarak ulaşılması istenen ideal kanser tedavisinde, normal dokular zarar görmeden tümörlü dokunun seçici olarak tanınması amaçlanmaktadır. Kanser hücrelerinin gelişimleri sırasında uğradığı fizyolojik ve morfolojik değişimler sonucunda ortaya çıkan tümöre özgü belirleyici moleküller, bu yapılara özgü ligandlar kullanılarak tanınmaktadır. Bu yönde geliştirilen yaklaşımlardan aktif hedeflendirmede amaç, vücutta bulunan sağlıklı dokuların tedaviden etkilenmesini önlemektir. Lenfatik sistem kanser hücrelerinin metastazında kilit rol oynadığından, kanserde metastazın önlenmesi amacıyla lenfatik hedeflendirme yaklaşımı önem kazanmıştır. Siklik yapıda, 9 aminoasitten oluşan LyP-1 (CGNKRTRGC), Laakkonen ve ark. tarafından 2002 yılında faj sunum tekniğiyle tanımlanan, tümör lenf damarlarına özgü bir peptittir. Bu tez kapsamında; meme kanseri hücreleri yüzeyinde yüksek miktarda bulunan ve LyP-1’e bağlanarak hücre içerisine alınmasını sağlayan p32 reseptörüne, LyP-1 içeren yağ bazlı nanofarmasötikler (kendiliğinden emülsifiye olabilen ilaç taşıyıcı sistemler, SEDDS) ile hedeflendirme yapılmıştır. Ayrıca, peptidin doksorubisin, anti-DTPA antikoru ve floresin ile konjugatları hazırlanmıştır. Hazırlanan tüm formülasyonların karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. SEDDS formülasyonlarının (sıvı ve katı) in vitro değerlendirmesi için Caco-2, MDA-MB-231 ve 4T1 hücre hatları kullanılmış; elde edilen sonuçlar doğrultusunda 4T1 fare meme kanseri modelinde in vivo etkililik çalışmaları yürütülmüştür. Bu tezin sonunda, peptit yapılı LyP-1’in parenteral ve oral yoldan uygulanabilecek SEDDS formülasyonları geliştirilerek, lenfatik hedeflendirme ile meme kanseri tedavisindeki potansiyeli gösterilmiştir