3 Boyutlu Yazıcı ile Metakrilatlanmış Jelatin/PRP Hidrojel ve Mezenkimal Kök Hücre İçeren Osteokondral Gradyan Sistemlerin Hazırlanması ve in-Vitro Etkinliklerinin Belirlenmesi

The aim of the presented doctoral thesis is to develop a gradient hydrogel system which loaded adipos tissue derived stem cells (AdMSCs) by using photoactivated platelet-rich plasma (PRP) gradient and 3D bioprinting method for using in the treatment of osteochondral damages. At the first stage of the doctoral thesis, bone tissue engineering studies were carried out. Primarily, differently from the traditional approach, synthesis of highly methacrylated (≥90%) gelatin (Gel-MA) was accomplished with the microwave energy. The bio-ink formed by the mixing of preosteoblastic MC3T3-E1 cells to the Gel-MA was crosslinked with UV (300-500 nm) in the presence of a photoinitiator (Irgacure) to form a stable hydrogel structure after 3D bioprinting. Thus, hydrogels with high mechanical strength, elastic structure, low biodegradation ratio (27%±1.9 at 35 days), and that support in-vitro bone formation were obtained. In the second stage of the thesis, cartilage tissue engineering studies were carried out. In this section, PRP which has growth factors was used as a guiding agent for chondrogenic differentiation. Primarily, PRP was photoactivated by a polychromatic light source (PAC, 600-1200 nm) differently from the traditional activation methods. Thus, controlled and long-term growth factor release was achieved from periodically photoactivated PRP. The PRP bio-ink formed by the addition of Gel-MA and ATDC5 chondrogenic cells to the PRP was photoactivated by PAC after the printing process. Then, the hydrogels were crosslinked with UV in the presence of Irgacure to form a stable hydrogel structure. As a result, hydrogels with high mechanical strength, which release growth factors for long term and constant rate and support in-vitro hyaline cartilage formation were acquired with the periodically PAC application. In the final step of the thesis study, adipose derived mesenchymal stem cells (AdMSCs) were separately mixed to Gel-MA, Gel-MA/PRP1:0.5 and Gel-MA/PRP1:1 solution, and then bio-inks gradually printed and photo crosslinked to form a gradient system. Gradient composite structure formed by the gradual mixing of PRP with Gel-MA has a synergistic effect on the differentiation of AdMSCs into cartilage, interface and bone phases. Mw-Gel-MA with osteoinductive and osteoconductive properties and PRP with activation-dependent release of a wide variety of bioactive agents in its structure have provided a favorable environment for differentiation of AdMSCs into osteochondral tissue. According to the results of cell viability, histology, immunocytochemistry, gene expression and biochemical analysis hydrogel systems which were periodically PAC-treated during cell culture supported the formation of in-vitro osteochondral tissue with progressively hyaline cartilage, hypertrophic cartilage, subchondral bone, and calcified bone. When the related literature is examined, there is no gradient system formed by using 3D bioprinter and AdMSC loaded photoactivated-Gel-MA/PRP composite bioinks and there is no in-vitro osteochondral gradient formation. This study is unique in this respect. Improvement of mechanical strength of Gel-MA with the microwave assisted methacrylation process and photoactivation of PRP/Gel-MA bioink the other unique aspects of the study.ÖZET i ABSTRACT iv TEŞEKKÜR vii İÇİNDEKİLER viii ŞEKİLLER DİZİNİ xiiii ÇİZELGELER DİZİNİ xxiiii SİMGELER VE KISALTMALAR xxv 1.GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1 Osteokondral Doku Yapısı 4 2.1.1. Bölgesel Kıkırdak 5 2.1.2. Subkondral Kemik 8 2.2. Osteokondral Hasarlar 8 2.2.2. Osteokondral Hasarların Tedavisi 9 2.2.2.1. Cerrahi (Onarıcı) Yöntemler 9 2.2.2.2. Yenileyici (Restoratif) Tedavi Yöntemleri 10 2.2.2.3. Osteokondral Doku Mühendisliği Yaklaşımları 10 2.3. Biyobaskılama (Bioprinting) 12 2.4. Biyoyazıcı (Bioprinter) 15 2.5. Biyoçözelti (Bioink) 18 2.5.1. Biyoçözeltinin özellikleri 18 2.5.2. Biyobaskılamada Kullanılabilen Biyoçözeltiler 19 2.5.3. Jelatin Tabanlı Biyoçözeltiler 22 2.6. Plateletçe Zengin Plazma (PRP) 24 2.6.1. Platelet Yapısı 24 2.6.2. Platelet Reseptörleri 27 2.6.3. Plateletlerde Şekil Değişikliği Mekanizması 28 2.6.4. Hemostazda Platelet Aktivasyonu ve Pıhtı Oluşumu 30 2.6.5 Hemostatik Olmayan İşlevler ve PRP’nin Biyoaktivitesi 33 2.6.6. PRP’nin Osteokondral Hasarlarda Klinik ve Doku Mühendisliği Uygulamaları 37 2.6.7. PRP Tedavisinin Güvenilirliği 38 2.7. Fotobiyouyarım (Fototerapi) 39 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 42 3.1. Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Kimyasal ve Biyolojik Malzemeler 43 3.2. Mw-Jel-MA Biyoçözeltisinin Geliştirilmesi ve Kemik Doku Mühendisliği Uygulamaları 46 3.2.1 Metakrilatlanmış Jelatin Üretim Prosesi 46 3.2.2. Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Analizi 47 3.2.3.Fab@Home Biyoyazıcı Sistem ile Metakrilatlanmış Jelatin Hidrojel Sentezi 48 3.2.3.1 Fab@Home Biyoyazıcı Sistemin Çalışma Prensibi 48 3.2.3.2 Fab@Home Biyoyazıcı ile Baskılanan Jel-MA Çözeltisinin Fotobaşlatıcı Varlığında UV ile Çapraz Bağlanması ve Hidrojel Oluşumu 48 3.2.4.Hidrojel Karakterizasyonu 49 3.2.4.1 Reolojik Analiz 49 3.2.4.2 Mekanik Analiz 49 3.2.4.3 Morfolojik Analiz (SEM) 50 3.2.4.4. Biyobozunurluk Tayini 50 3.2.5. In-vitro Kemik Doku Farklılaşma Çalışmaları 50 3.2.5.1 Hücre Canlılığının Belirlenmesi 51 3.2.5.2 Hücre Çoğalmasının Belirlenmesi 52 3.2.5.3 Hücre Morfolojisi Analizleri 52 3.2.5.4 Biyokimyasal Analizler: Hücre Farklılaşması 53 3.2.5.5. Gen Ekspresyonu Analizi: Hücre Farklılaşması 54 3.3. PRP Biyoçözeltisinin Hazırlanması ve Kıkırdak Doku Mühendisliği Uygulamaları 56 3.3.1. İnsan Kanından PRP İzolasyonu 56 3.3.2. Jel-MA/PRP Hidrojel Oluşumu ve Karakterizasyon Çalışmaları 56 3.3.3. Platelet ve Jel-MA/Platelet Aktivasyon Çalışmaları 57 3.3.3.1 Fotoaktivasyon 57 3.3.3.4. ATP Analizi 59 3.3.3.5. Kalsiyum Analizi 59 3.3.3.6 Morfolojik Analiz 59 3.3.3.7 Akış Sitometrisi Analizi 59 3.3.4. Fotoaktifleştirilmiş PRP’den ve Jel-MA/PRP Hidrojellerden İn-Vitro Büyüme Faktörü Salım Çalışmaları 59 3.3.5. Hücre Kültürü Koşulları 61 3.3.6. Hücre Kültürü Çalışmaları 62 3.3.6.1. Hücre Canlılığı Analizi 62 3.3.6.2. Hücre Çoğalması Analizi 62 3.3.6.3. Taramalı Elektron Mikroskobu ile Hücre Morfolojisi Analizi 62 3.3.6.4. Histolojik Analizler: Hücre Morfolojisi ve Farklılaşması 63 3.3.6.5. İmmünositokimya Analizleri: Hücre Farklılaşması 64 3.3.6.6. Biyokimyasal Analizler-Hücre Farklılaşması 64 3.3.6.7. Gen Ekspresyonu Analizi-Hücre Farklılaşması 65 3.4. İn-vitro Osteokondral Gradyan Sistem Geliştirilmesi 65 3.4.1 3B Biyobaskılama Yöntemi ile Osteokondral Gradyan Sistem Hazırlanması 66 3.4.2. Hidrojel Karakterizasyon Çalışmaları 68 3.4.3. In-Vitro Osteokondral Farklılaşma Çalışmaları 68 3.4.3.1. Hücre Canlılığı Analizi 69 3.4.3.2. Hücre Çoğalması Analizi 69 3.4.3.3. Histolojik İncelemeler 70 3.4.3.4. İmmünositokimyasal Analiz 70 3.4.3.5. Biyokimyasal Analizler 71 3.4.3.6. Gen Ekspresyon Analizi 71 3.5. İstatistiksel Analiz 72 4. SONUÇLAR ve TARTIŞMA 73 4.1. Mw-Jel-MA Biyoçözeltisinin Geliştirilmesi ve Kemik Doku Mühendisliği Uygulamaları 73 4.1.1 Mikrodalga Destekli Jel-MA Sentezi ve Karakterizasyonu 73 4.1.2. Hidrojel Oluşumu 79 4.1.3. Hidrojel Karakterizasyon Çalışmaları 82 4.1.3.1. Reolojik Analiz 82 4.1.3.2. Mekanik Dayanım 87 4.1.3.3. Biyobozunurluk 90 4.1.3.4. SEM analizi 92 4.1.4. Hücre Kültürü Çalışmaları 93 4.1.4.1. Hücre Canlılığının Belirlenmesi 93 4.1.4.2. Hücre Proliferasyonunun Belirlenmesi 95 4.1.4.3. Hücre Morfolojisinin İncelenmesi 97 4.1.4.4. Hücre Farklılaşmasının Belirlenmesi: Gen ekspresyonu 102 4.1.4.5. Hücre Farklılaşmasının Belirlenmesi: Biyokimyasal Analizler 104 4.2. PRP Destekli Biyoçözelti Geliştilmesi ve Kıkırdak Doku Mühendisliği Uygulamaları 106 4.2.1. PRP İzolasyon ve Aktivasyon Çalışmaları 107 4.2.1.1. ATP ve Kalsiyum Analizi 108 4.2.1.2. Morfolojik Analiz 110 4.2.1.3. Akış Sitometrisi Analizi 115 4.2.2. PRP’den İn-Vitro Büyüme Faktörü Salım Çalışması 119 4.2.3. Jel-MA/PRP Hidrojel Oluşumu 122 4.2.4. Hidrojel Karakterizasyon Çalışmaları 124 4.2.4.1. Reolojik Analiz 124 4.2.4.2. Biyobozunurluk Tayini 127 4.2.5. Jel-MA/PRP Hidrojellerde Aktivasyon Çalışmaları 129 4.2.5.1. ATP ve Kalsiyum Analizi 130 4.2.5.2. Morfolojik Analiz 131 4.2.6. Hidrojellerden İn-Vitro Büyüme Faktörü Salım Çalışmaları 134 4.2.7 Hücre Kültürü Çalışmaları 137 4.2.7.1. Hücre Canlılığının Belirlenmesi 137 4.1.7.2.Hücre Proliferasyonunun Belirlenmesi 139 4.2.7.3. Morfolojik Analiz 142 4.2.7.4. Histoloji Analizleri 146 4.2.7.5. İmmünositokimya Analizi 150 4.2.7.6. Gen Ekspresyonu Analizi 153 4.2.7.7. Biyokimyasal GAG Tayini 157 4.3. Osteokondral Gradyan Sistemlerin Geliştirilmesi ve İn-vitro Osteokondral Gradyan Doku Oluşumu 158 4.3.1.Kompozit Osteokondral Sistemlerin Geliştirilmesi 158 4.3.2. Karakterizasyon Çalışmaları 159 4.3.2.1.Reolojik Analiz 159 4.3.2.3. Biyobozunurluk Analizi 161 4.3.3. Hücre Kültürü Çalışmaları 163 4.3.3.1. Hücre Canlılığının Belirlenmesi 163 4.3.3.2. Hücre Proliferasyon Analizi 166 4.3.3.3.Hücre Morfolojisi Analizi (H&E) 167 4.3.3.4. İmmünositokimya ve Histoloji ile Hücre Farklılaşması Sonuçları 170 4.3.3.5. RT-PCR Analizi 176 4.3.3.6. Biyokimyasal Analizler 180 5. GENEL SONUÇLAR 183 6. KAYNAKLAR 187 EKLER 197 EK-1 Kalsiyum Analizi Kalibrasyon Grafiği 197 EK 2 Etik Kurul Belgesi 198 EK 3 ATP Analizi Kalibrasyon Grafiği 199 EK 4 İn-Vitro Salım Çalışmalarında Kullanılan TGF-ß, bFGF, PDGF Kalibrasyon Grafikleri 200 EK 5 Örnek Kümülatif Salım Profilleri ve Salım Kinetik Modelleri 202 EK 6 Histoloji Yöntemi 204 EK 7 GAG Analizi Kalibrasyon Grafiği 206 ÖZGEÇMİŞ 208Sunulan doktora tezinin amacı, osteokondral hasarların tedavisinde kullanılmak üzere fotoaktifleştirilmiş plateletçe zengin plazma (PRP) gradyanı ve 3B biyobaskılama yöntemi kullanılarak adipoz kökenli mezenkimal kök hücreleri (AdMSC) yüklü gradyan hidrojel sistem geliştirmektir. Doktora tez çalışmasının ilk aşamasında kemik doku mühendisliği çalışmaları yürütülmüştür. Öncelikle, geleneksel yaklaşımdan farklı olarak mikrodalga enerjisi (Mw) ile yüksek oranda metakrilatlanmış (≥%90) jelatin (Jel-MA) sentezi gerçekleştirilmiştir. Preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri Jel-MA‘ya ilave edilerek oluşturulan biyoçözelti 3B biyobaskılandıktan sonra kararlı hidrojel yapıyı oluşturmak üzere fotobaşlatıcı (Irgacure) varlığında UV (300-500 nm) ile çapraz bağlanmıştır. Böylelikle mekanik dayanımı yüksek, elastik yapıda, düşük biyobozunma oranına (35 günde %27±1.9) sahip ve in-vitro kemik oluşumunu destekleyen hidrojeller elde edilmiştir. Tez çalışmasının ikinci aşamasında ise kıkırdak doku mühendisliği çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu bölümde büyüme faktörlerini yapısında bulunduran PRP, kondrojenik farklılaşmayı yönlendirici ajan olarak kullanılmıştır. İlk olarak PRP, geleneksel aktivasyon yöntemlerinden farklı olarak polikromatik ışık kaynağı (PAC, 600-1200 nm) ile fotoaktive edilmiştir. Böylece, periyodik olarak fotoaktive edilen PRP’den kontrollü ve uzun dönemde büyüme faktörü salımı sağlanmıştır. PRP’ye, Jel-MA ve ATDC5 kondrojenik hücrelerinin eklenmesiyle oluşturulan PRP biyoçözeltisi biyobaskılandıktan sonra, PAC ile fotoaktive edilmiştir. Ardından, hidrojeller, kararlı yapının elde edilebilmesi için Irgacure varlığında UV ile çapraz bağlanmıştır. Sonuçta, periyodik olarak PAC uygulaması ile mekanik dayanımı yüksek, uzun süreli ve sabit hızda büyüme faktörü salan ve in-vitro hiyalin kıkırdak oluşumunu destekleyen hidrojeller elde edilmiştir. Tez çalışmasının son aşamasında, adipoz kökenli mezenkimal kök hücreler (AdMSC’ler) Jel-MA, Jel-MA/PRP1:0.5 ve Jel-MA/PRP1:1 çözeltilerine ayrı ayrı ilave edildikten sonra gradyan sistemi oluşturacak şekilde aşamalı olarak biyobaskılanmış ve fotoçapraz bağlanmıştır. PRP’nin Jel-MA ile aşamalı olarak karıştırılması ile oluşturulan gradyan kompozit yapı, AdMSC’lerin kıkırdak, ara yüzey ve kemik fazlarına farklılaşmasında sinerjik bir etki yaratmıştır. Osteoindüktif ve osteokondüktif özelliklere sahip Mw-Jel-MA ve yapısında bulundurduğu yüksek çeşitlilikteki biyoaktif ajanların aktivasyon bağımlı salınması ile osteokondral rejenerasyonu arttırıcı etkisi bulunan PRP, AdMSC’lerin osteokondral dokuya farklılaşmaları için uygun bir ortam sunmuştur. Yapılan hücre canlılığı, histoloji, immünositokimya, gen ekspresyonu ve biyokimyasal analizler sonuçlarına göre hücre kültürü süresince periyodik olarak PAC uygulanan hidrojel sistemler, aşamalı olarak hiyalin kıkırdak, hipertropik kıkırdak, subkondral kemik ve kalsifiye kemiğe sahip in-vitro osteokondral doku oluşumunu desteklemiştir. İlgili literatür incelendiğinde AdMSC yüklü fotoktifleştirilmiş-Jel-MA/PRP kompozit biyoçözeltisi ile 3B biyoyazıcı kullanılarak oluşturulmuş gradyan sistem ve in-vitro koşullarda elde edilmiş osteokondral gradyan doku oluşumu bulunmamaktadır. Çalışma bu açıdan özgündür. Mikrodalga destekli metakrilatlama prosesi ile Jel-MA’nın mekanik dayanımının iyileştirmesi ve PRP/Jel-MA biyoçözeltisinin fotoaktifleştirilmesi çalışmanın diğer özgün yanlarını oluşturmaktadır