Mutational analysis of non-coding 5\'UTR and promoter region P2 of GJB1 gene in individuals affected by CMTX type 1

Introdução: Até bem pouco tempo atrás a análise mutacional de regiões gênicas não codificantes raramente eram reportadas em estudos genéticos sobre doenças hereditárias. Geralmente, o enfoque desses estudos recaiam sobre as regiões ditas codificantes, também conhecidas como regiões exônicas. Com o progresso da tecnologia em biologia molecular, especialmente após o desenvolvimento do sequenciamento em larga escala, temos observado um avanço jamais visto antes no entendimento de como opera o genoma humano e consequentemente uma mudança de paradigmas. Estudos mais recentes tem abrangido consistentemente a análise mutacional de regiões não codificantes ou regulatórias. No caso da neuropatia de \"Charcot-Marie-Tooth\" (CMT), pouco ainda se sabe sobre os fenótipos resultantes de mutações localizadas em sequencias regulatórias dos genes relacionados a doença. Por exemplo, na CMT ligada ao cromossomo X do tipo 1 (CMTX1), que é causada por mutações no gene GJB1 que codifica para a proteína canal conexina 32, apenas 0.01% das mutações já detectadas no gene estão presentes na região 5\' UTR (Untranslated Region) (KABZINSKA et al., 2011). Objetivos: Em vista disso, o propósito deste estudo foi a analise mutacional da região não codificante 5\' UTR e região promotora P2 do gene GJB1. Mais precisamente, 600 pares de bases upstream a open Reading frame (ORF) do transcrito do gene GJB1 expresso no sistema nervoso. Métodos: Foram investigados 100 pacientes em andamento no ambulatório de neurologia do Hospital das Clinicas da Faculdade de medicina de Ribeirão preto USP (FMRP - USP) com sintomas sugestivo de CMTX do tipo 1 e que não apresentaram mutação alguma na região codificadora do mesmo gene em triagens posteriores. Para tanto foram realizadas as técnicas de PCR (para amplificação do DNA) e posteriormente o sequenciamento do produto amplificado por meio do sequenciamento de Sanger. Resultados: Três variantes foram detectadas em 4 pacientes não relacionados, duas alterações intrônicas (já descritas) e uma nova alteração, encontrada no exon 1B (não codificante) do gene GJB1. Conclusão: Os resultados obtidos em nosso estudo sugerem que mutações na região 5\' UTR do gene GJB1 na população brasileira são incomuns e aparentemente não são responsáveis por casos sugestivos de CMTX1 sem causa genética atribuída.Introduction: Until recently mutational analysis of non-coding regions of the DNA were rarely reported on genetic studies about inherited disorders. Usually, the approach of those studies relied primarily on the analysis of the coding regions of the DNA, also known as exonic regions. However, with the progress of science in molecular biology, especially after the development of the high throughput sequencing technology, we have observed an advance never seen before regarding of how the human genome operates and consequently a paradigm shift. New studies have consistently covered these regulatory or non-coding regions of the DNA. In the case of Charcot-Marie-Tooth disease (CMT), little is known about the phenotypes resulting from mutations in the regulatory sequences of the genes related to the disease. For example, in the X linked CMT type 1 (CMTX1), caused by alterations in the GJB1 gene that encodes for the Channel like protein connexin32 (CX32), only 0.01% of the mutations ever found in the gene were actually localized in its 5\' untranslated region (5\'UTR) (KABZINSKA et al., 2011). Objectives: Considering it, the purpose of this study was the mutational analysis of the 5\' non-coding region and promoter region P2 of GJB1 gene. More specifically, 600 base pairs (bp) upstream of the open reading frame (ORF) of the transcript expressed in the nervous system (NS). Methods: 100 patients in progress in the Clinical Hospital of the Medical School at University of São Paulo presenting suggestive clinical diagnoses of CMTX1 were screened for mutations in the region of interest, after mutations in the coding region of GJB1 gene were excluded in previous analysis. Therefore, we performed a Polimerase Chain Reaction (to amplify the DNA) followed by sequencing of the amplified material via Sanger sequencing. Results: We detected 3 alterations in 4 unrelated patients, 2 intronic variants (already described) and a novel mutation in the non-coding exon 1B of the GJB1 gene. Conclusion: The obtained results in our study suggest that mutations in the 5\'UTR of the GJB1 gene in the Brazilian population are uncommon and apparently they are not a major cause of CMTX1 in genetic unassigned patients with a suggestive clinical diagnosis of CMTX1