사람 간성상세포주 및 백서에서 Magnesium lithospermate B의 항섬유화 효과

Dept. of Medicine/박사[한글] 간섬유화 현상은 간 조직에서 나타나는 상처치유 과정의 일종으로서 거듭되는 간조직의 손상과 재생과정을 통하여 간경변증이 발생되고 있다. 현재까지 수많은 항섬유화 치료가 시도되었으나 효과적인 항섬유화 약제로 사용되는 물질은 없다. 약초의 일종인 Salvia miltiorrhiza의 추출물은 페놀화합물로 구성되어 있으며 중국에서 혈관계통의 질환 치료에 널리 이용되고 있다. Salvia miltiorrhiza의 주요 성분중의 하나인 magnesium lithospermate B (LAB)는 항산화 효과로 신장보호 성질을 가지고 있다고 알려져 있다. 이에 저자는 사람 간성상세포주 및 백서에서 LAB의 항섬유화 효과를 알아보고자 하였다. 동물 간섬유화 모델은 thioacetamide (TAA) 랫드 모델을 사용하였다. 사람 간성상세포주는 정상 사람 간조직으로부터 간성상세포를 분리한 뒤에 레트로바이러스를 이용하여 불멸화시킨 human telomerase reverse transcriptase (hTERT) 간성상세포주를 사용하였다. 랫드는 각 군당 5마리씩 6개 군으로 분류하였다. 대조군 5마리, LAB투여군 5마리, TAA 투여군 10마리, TAA와 LAB 투여군 10마리로 하여 TAA 투여군 5마리와 TAA 및 LAB 동시 투여군 5마리는 8주에 희생하였으며 나머지는 12주에 희생하였다. 간조직을 Masson's trichrome 염색과 -smooth muscle actin ( -SMA) 면역화학 염색을 시행 후 컴퓨터 이미지 분석을 통하여 염색된 면적을 구하였다. 간 손상 정도를 측정하기 위하여 랫드 희생 시 수집한 혈액에서 aspartate aminotransferase (AST)와 alanine transferase (ALT)를 측정하였다. 역전사효소 중합효소연쇄반응을 이용하여 -SMA, transforming growth factor- (TGF- )와 type I collagen 1의 mRNA 수치를 상대적으로 측정하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 이용하여 LAB의 세포독성 및 세포 증식 억제 효과를 측정하였다. 과산화수소 처리 후 발생하는 세포 내 반응성 산소기 억제 효과를 측정하였으며 tumor necrosis factor- (TNF- )를 처리 후 nuclear factor- B (NF- B)의 전사 활성도의 억제 정도를 측정하였다. 간성상세포에서 분비한 I형 교원질 및 안지오텐신 II에 처리 후 extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2)의 표현이 LAB에 의해 억제되는지 측정하였다. 면역화학염색 결과 TAA 단독 투여 군에 비하여 TAA와 LAB를 동시에 투여한 군의 염색된 면적이 유의하게 낮았다. 8주 TAA군에 비하여 8주 TAA와 LAB 동시 투여군에서 AST, ALT 모두 의미 있게 낮은 수치를 보였으나 12주 TAA군과 12주 TAA와 LAB 동시 투여군에서는 의미 있는 차이가 없었다. -SMA, TGF- 와 type I collagen 1의 상대적 mRNA 수치는 TAA군에 비해 TAA와 LAB 동시 투여군에서 유의하게 낮은 결과를 보였다. MTT를 이용한 간성상세포 독성 실험 결과 LAB 40 ?M까지는 세포 독성을 보이지 않았다. PDGF 및 LAB를 동시에 투여한 간성상세포는 PDGF 단독 투여한 세포에 비하여 증식이 억제되었다. 과산화수소로 자극하여 세포내 반응성 산소기를 측정한 결과 LAB로 전 처리한 간성상세포가 전 처리하지 않은 세포에 비하여 반응성 산소기가 의미있게 억제되는 소견을 보였다. TNF- 를 처리하였을 때 간성상세포에서 NF- B의 전사 활성도가 증가하였으며 LAB를 전 처리한 간성상세포에서는 NF- B의 전사 활성도가 의미 있게 감소함을 보였다. Western blot 결과 LAB를 처리한 간성상세포에서 분비한 I형 교원질의 양이 처리하지 않은 세포와 비교하여 적게 나타났다. 안지오텐신 II가 ERK 1/2의 인산화를 유도하였으며 LAB를 전처리한 간성상세포에서는 ERK 1/2의 표현이 감소되었다. LAB는 항산화 작용으로 ERK 경로 및 NF- B 신호전달체계 차단하여 사람 간성상세포 증식 및 교원질 생성을 억제하였으며 TAA로 유도한 랫드 간경변 모델에서 간섬유화 억제를 보였다. 결론적으로 사람 간성상세포주 및 랫드 간경변 모델에서 LAB의 항섬유화 효과를 확인하였다. [영문] Hepatic fibrosis refers to a wound-healing response to a variety of insults, ultimately leading to cirrhosis. Recently, magnesium lithospermate B (LAB), one of the major active components from Salvia miltiorrhizae, has been given attention for its anti-fibrogenic effects. The antifibrotic effect of LAB in an experimental rat model was demonstrated. The aim of this study was to elucidate the antifibrogenic mechanism of LAB. Sprague-Dawley rats were divided into 6 groups: the control group (n = 5), control + LAB group (n = 5), TAA 8-week group (n = 5), TAA + LAB 8-week group (n = 5), TAA 12-week group (n=5) and TAA + LAB 12-week group (n = 5). The serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were tested. Masson's trichrome stain and α-smooth muscle actin ( -SMA) stain of liver sections were analyzed. The relative levels of mRNA expressions of -SMA, transforming growth factor- (TGF- ) and type I collagen 1 were measured using real-time PCR. The human hepatic stellate cell (HSC) line was used for in vitro analysis. Cell cytotoxicity and proliferation were evaluated. Intracellular reactive oxygen species (ROS) formation was measured using H2DCFDA labeling. Nuclear factor- B (NF- B) transcriptional activation induced by tumor necrosis factor- (TNF- ) was measured using luciferase activity after virus vector transfer. Secreted type I collagen expression and phospho-extracellular signal regulated kinase (ERK) was evaluated using Western blots. LAB attenuated fibrosis in liver sections. The serum levels of AST and ALT were significantly lower in the TAA + LAB 8-week group than in the TAA 8-week group. LAB significantly decreased the mRNA levels of -SMA, TGF- and type I collagen 1. LAB treatment up to 40 ?M did not show any discernable toxicity. Platelet-derived growth factor (PDGF)-induced proliferation of HSCs was suppressed by LAB. H2O2-induced ROS formation in HSCs was decreased by LAB. Western blot demonstrated that LAB decreased type I collagen secretion and phospho-ERK expression in HSCs. In conclusion, the results of this study suggest that LAB may attenuate the activation of human HSCs through antioxidant activity. LAB demonstrated an antifibrogenic effect on TAA-induced cirrhosis in Sprague-Dawley ratsope