HSP90 샤페론 시스템을 활용한 약물 스크리닝과 HSP90 클라이언트 단백질 가용성 증대 연구

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 화학생물공학부, 2016. 8. 한지숙.Abstract in Korean 국 문 초 록 Hsp90 샤페론 시스템은 Hsp90의 클라이언트 (client) 단백질로 분류되는 다양한 단백질들의 접힘과 활성화, 안정화에 있어서 중요한 역할을 수행한다. Hsp90의 클라이언트 단백질들 중에는 여러 암유발 단백질들 (oncoprotein)이 포함되어 있기 때문에, Hsp90의 활성저해제로 작용할 수 있는 다양한 골격 (scaffold)의 화합물들이 항암제로서 심도있게 연구, 개발되어왔다. 본 연구에서는 가상 스크리닝과 실험적 스크리닝을 활용하여 발굴된 2종의 새로운 골격을 갖는 Hsp90 활성저해제들의 특성을 규명하였다. 가상 스크리닝은 수정된 AutoDock 프로그램으로 수행되었으며, 각 화합물의 결합방식은 분자동역학 시뮬레이션을 통해 가시화되었다. 이 2종의 화합물들은 in vitro상에서 효모 Hsp90의 ATP가수분해 활성을 저해하였으며, MCF-7 유방암 세포주에 대해 생장억제 효과를 나타내었다. 이들 화합물들을 구성하는 골격들은 각각 pyrimidine-2,4,6-trione과 4H-1,2,4-triazole-3-thiol이었다. 라이브러리 상에서 이 골격들을 공유하는 화합물들을 추가적으로 선정하여, 이 화합물들이 Hsp90의 클라이언트 단백질이며 암유발 단백질인 Her2의 안정성에 미치는 영향을 살펴보았다. 결과적으로, 선정된 6종 중에서 5종의 화합물들이 Her2단백질의 감소를 유발하였으며, 이 결과를 통해 새롭게 발굴된 2종의 골격이 Hsp90 활성저해의 특성을 나타냄을 확인하였다. 또한 이와 같은Hsp90 활성저해제들의 성공적인 발굴을 통해, 가상 스크리닝이 신약개발에 유용하게 활용될 수 있음을 제시하였다. Hsp90 샤페론 시스템은 Hsp90 이합체와 Hsp90의 기능을 조절하고 보조하는 Hsp90 코샤페론 (cochaperone)들로 구성된다. Hsp90 뿐아니라 p23, Cdc37, SGT1, FKBP51, PP5 등과 같은 몇몇 Hsp90 코샤페론들 또한 암과의 연관성이 제기되었다. 이중 PP5는 PPP family에 속한 탈인산화효소이며, 이 PPP family에 속한 탈인산화효소들은 구조적으로 매우 유사한 촉매 도메인 (catalytic domain)을 지닌다. 현재까지 알려진 천연물 PP5 활성저해제들은 이 촉매 도메인에 결합하므로, PPP family에 속한 여러 탈인산화효소들에 대해 광범위한 선택성을 나타낸다. 본 연구에서는 이러한 기존의 비특이적인 PP5 활성저해제들과는 다른, 새로운 기작으로 작용하는 PP5 활성저해제를 탐색하기 위해 LOPAC (Library Of Pharmacologically Active Compounds) 1280 라이브러리에 포함된 화합물들로 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 3종의 PP5활성저해제를 발굴할 수 있었다. 이 활성저해제들의 작용기작을 규명하기 위해, PP5의 전체 길이 (full-length) 단백질, 그리고 탈인산화 활성을 자가억제하는 PP5의 TPR도메인과 C말단 13개 아미노산이 각각, 또는 모두 결손된 단백질들의 활성에 이 화합물들이 미치는 영향을 어세이로 확인하였다. 이를 통해 기존의 PP5 활성저해제들과는 다른, PP5에 대해 TPR-의존적 활성저해 기작을 나타내는 1종의 활성저해제 Ro 90-7501을 확인할 수 있었다. TPR도메인은 PPP family에 속한 탈인산화효소들 중에서 PP5만이 지니는 고유한 도메인이기 때문에 TPR-의존적인 PP5 활성저해제는 PP5-특이적인 활성저해제로서 작용할 가능성이 있으며, 신약개발이나 PP5 활성연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다. Hsp90 샤페론 시스템은 클라이언트 단백질들의 접힘, 활성화, 그리고 안정화의 기능을 수행한다. NOD1은 Hsp90의 클라이언트 단백질 중 하나이며, 염증성 질병들과 연관된 세포 내의 선천성 면역 센서이다. NOD1 단백질은 발현 및 분리정제가 매우 어려운 것으로 알려져 있으며, 이는 NOD1에 대한 분자수준의 연구에 걸림돌이 되어왔다. 본 연구에서는 Hsp90 샤페론 시스템을 활용하여 NOD1 단백질의 LRR 도메인을 대장균 내에서 가용성 상태로 발현하고자 하였다. 인간 암세포주로 수행된 기존의 연구보고에 따르면 Hsp90 코샤페론 SGT1은 NOD1의 활성에 필요하며, Hsp90는 NOD1의 안정성에 기여한다. 이를 기초로 SGT1을 NOD1 단백질의 LRR 도메인과 융합할 파트너 단백질로 선정하였다. 인간 SGT1을 NOD1-LRR의 N말단에 융합한 융합단백질 HsSGT1NOD1LRR은 향상된 가용성을 나타내었으나, 극심한 분해와 낮은 발현량을 나타내었다. 이를 극복하기 위해 효모, 대장균, 마우스 유래의 Hsp90들을 공발현 단백질로 선정하여 그 효과를 확인하였다. 기존의 보고와 일관된 결과로서, Hsp90의 공발현은 융합단백질의 안정성을 향상시켰다. 대장균 HtpG, 효모 Hsp82와 Hsc82, 마우스 Hsp90α 등 다양한 유래의 Hsp90들의 공발현 효과를 비교하였을 때, 마우스 Hsp90α가 공발현시 가장 효과적으로 SGT1NOD1LRR 융합단백질을 안정화시킴을 관찰하였다.ABSTRACT Utilization of HSP90 chaperone machinery for drug screening and enhancement of HSP90 client protein solubility Tae-Joon Hong School of Chemical and Biological Engineering The Graduate School Seoul National University Hsp90 chaperone machinery performs crucial functions in the folding, activation, and stabilization of a wide range of proteins called Hsp90 client proteins. As Hsp90 client proteins include various oncoproteins, diverse classes of Hsp90 inhibitors have been developed intensively as anti-cancer drugs. By utilizing both virtual and experimental screening, two Hsp90 inhibitors with novel scaffolds could be identified and characterized in this work. The virtual screening was performed with modified AutoDock program and the binding mode of each compound was visualized by molecular dynamics simulations. The two compounds inhibited the ATPase activity of yeast Hsp90 in vitro, and showed antiproliferative effects on MCF-7 cells. One compound had pyrimidine-2,4,6-trione scaffold, while the other retained 4H-1,2,4-triazole-3-thiol. Together with the two identified compounds, additional compounds that share these scaffolds were selected from the library and tested for their effects on Her2, one of the oncogenic Hsp90 client proteins. The result demonstrated that most of these compounds induced Her2 degradation in MCF-7 cells, confirming the Hsp90 inhibitory property of the newly identified scaffolds. Also, by the successful identification of the Hsp90 inhibitors, the effectiveness of virtual screening for drug discovery has been demonstrated. Hsp90 chaperone machinery operates through dynamic interactions of Hsp90 with its cochaperones that regulate and assist the functions of Hsp90. Like Hsp90, several Hsp90 cochaperones such as p23, Cdc37, SGT1, FKBP51, and PP5 have been implicated in cancer. PP5 belongs to the PPP phosphatase family whose members share significantly similar catalytic domain structure. As the known, natural inhibitors of PP5 bind to the catalytic domains of PPP family phosphatases, they exhibit broad specificity over the phosphatases of PPP family. In an attempt to identify PP5 inhibitors that act through novel, allosteric mechanisms, drug screening was performed with the compounds from the library of pharmacologically active compounds (LOPAC) 1280. As a result, three compounds were selected as PP5 inhibitors. Unlike other inhibitors, one of these inhibitors, Ro 90-7501 exhibited TPR-dependent inhibition in the assays performed with full-length PP5 and the deletion constructs of PP5 which lack either or both of the regulatory regions, the TPR domain and the C-terminal 13 amino acids. As the TPR domain is a unique feature of PP5 among the PPP family phosphatases, the TPR-dependent inhibitor might be a useful tool for both the researches of PP5 and the drug discovery of PP5-specific inhibitors. Hsp90 chaperone machinery promotes the folding, activation and stabilization of its client proteins. NOD1, one of the Hsp90 client protein, is an important intracellular sensor of innate immunity which is related to a number of inflammatory diseases. Molecular level researches of NOD1 have been greatly retarded because expression and purification of soluble, active NOD1 protein have proven extremely difficult. For the soluble expression of the NOD1-LRR domain in E. coli, Hsp90 chaperone machinery was utilized. It has been reported that Hsp90 cochaperone SGT1 was necessary for the activation of NOD1, while Hsp90 was required for the stability of NOD1 in human cell line. Based on these observations, SGT1 was chosen as the fusion partner of NOD1-LRR. The fusion protein of human SGT1 and NOD1-LRR exhibited enhanced solubility, but it suffered severe degradation and low expression level. To overcome this drawback, Hsp90s from yeast, E. coli, and mouse were tested as coexpression partners. The coexpression of Hsp90s enhanced the stability of the fusion protein to some extent, in accordance with the previous report. The comparison between E. coli HtpG, yeast Hsp82 and Hsc82, mouse Hsp90α demonstrated that the coexpression of mouse Hsp90α was most effective for stabilizing SGT1NOD1LRR fusion protein.Chapter 1. Research background and objective 1 Chapter 2. Literature review 4 2.1. Hsp90 chaperone machinery 5 2.1.1. Hsp90 molecular chaperone 5 2.1.2. Hsp90 as an anti-cancer target 6 2.1.3. Hsp90 chaperone cycle 9 2.1.4. Hsp90 cochaperones 12 2.1.5. Asymmetry of Hsp90 chaperone machinery 13 2.2. Protein phosphatase 5 (PP5) 17 2.2.1. Overview of protein phosphatase 5 17 2.2.2. The structure of PP5 17 2.2.3. Cellular functions and diseases related to PP5 21 2.2.4. Regulators of PP5 phosphatase acitivity 24 2.3. Nucleotide-binding oligomerization domain-containing 1 (NOD1) 27 2.3.1. NOD-like receptors (NLRs) 27 2.3.2. NOD1 protein purification 31 2.3.3. Overview of SGT1 33 2.3.4. SGT1-Hsp90 complex and NOD1 36 Chapter 3. Materials and methods 38 3.1. Plasmid DNA vectors for protein expression 39 3.2. Protein expression and purification 43 3.3. Structure-based virtual screening with modified AutoDock 44 3.4. Molecular dynamics for Hsp90-inhibitor comlexes 47 3.5. In vitro Hsp90 ATPase assay 48 3.6. Sulforhodamine B (SRB) assay 49 3.7. Cell-based Her2 degradation assay 50 3.8. PP5 phosphatase assay 51 3.9. SGT1NOD1LRR fusion protein expression 52 Chapter 4. Virtual and experimental screening to identify new Hsp90 inhibitor scaffolds 54 4.1. Introduction 55 4.2. Virtual screening with modified AutoDock program 57 4.3. Inhibitory and antiproliferative effects of the compounds 59 4.4. Molecular dynamics simulations of the compounds 61 4.5. Her2 degradation assay with compounds sharing the scaffolds 65 4.6. Conclusions 67 Chapter 5. Screening of PP5 inhibitors that act through different mechanisms 69 5.1. Introduction 70 5.2. Screening of LOPAC1280 by PP5 phosphatase assay 70 5.3. Confirmation of the primary screening 71 5.4. Mechanism study of the screened compounds 71 5.5. Conclusions 81 Chapter 6. Enhancing the solubility of NOD1-LRR in E. coli 82 6.1. Introduction 82 6.2. Expression of full-length NOD1 protein in E. coli 85 6.3. Expression of NOD1-LRR domain in E. coli 86 6.4. Expression of SGT1NOD1LRR fusion protein in E. coli 88 6.5. Conclusions 102 Chapter 7. Overall discussion and recommendations 105 Bibliography 111 Abstract in Korean 124Docto