FRET 테크놀로지를 이용한 생체내 고속 단백질-단백질 상호작용 분석시스템의 개발

Dept. of Medical Science/석사[한글] 세포의 각종 생명현상들은 복잡한 단백질-단백질 상호작용 네트워크로 이루어져 있다. 단백질간의 상호작용 및 상호작용의 세포 안에서의 기능 규명은 게놈 프로젝트, 프로테옴 기술의 발달에 따라 엄청나게 쏟아지고 있는 단백질 정보로부터 의-약학적 응용기술, 신약개발에 필수적이므로 단백질간 상호작용을 빠르게 규명하는 기술이 절대적으로 필요하다. 하지만 기존의 검색 방법으로는 대량의 단백질-단백질 상호작용 조사가 사실상 불가능하므로 본인은 다수의 단백질간 상호작용을 빠르게 연구하는 것이 가능한 새로운 방법을 개발하였다. 새로운 방법은 Gateway 시스템과 FRET 테크놀로지를 채택하였다. Gateway 시스템의 람다 파지의 서열 특이적 재조합 반응을 이용하여 제한효소를 사용하지 않고도 더욱 빠르고 더 높은 효율로 동시에 많은 목적 유전자들의 클로닝이 가능하도록 하였고, FRET 테크놀로지의 두 개의 상호 작용하는 단백질들이 생체 내에서 접근하여 상호작용이 일어나는 경우 에너지 전도로 인하여 새로운 파장의 형광을 발광(發光)하는 현상을 관찰함으로써 고속으로 생 세포`내에서 단백질간의 상호작용을 검색할 수 있는 시스템이다.본 연구에서는 POZ-도메인 단백질에 의한 세포 기능 조절을 이해하기 위하여, 새롭게 개발된 시스템을 이용하여 POZ-도메인 단백질간의 상호작용이 고속으로 분석가능한지를 조사하였다. 방법을 개발하여 이용하였다. 먼저 Prive 박사의 BTB도메인 데이터베이스에서 사람의 POZ 도메인 아미노산 서열을 수집한 다음, 아미노산 서열의 상동성 결과를 바탕으로 계통수를 작성하였고 이를 바탕으로 FBI-1과 가장 높은 상동성을 갖는 APM-1과 KL10을 선택하였다. 이들 POZ 도메인간의 상호작용을 새로운 시스템을 이용하여 조사한 결과 APM-1 POZ 도메인과 FBI-1 POZ 도메인은 homodimer 및 서로 결합하여heterodimer를 잘 이루나 KL10 POZ의 경우 약한homodimerization 과 AMP-1 POZ, FBI-1 POZ와 약하게 heterodimer 를 이루는 것이 관찰되었다. 이들 POZ 단백질간의 상호작용을 기존의 mammalian two hybrid assay를 이용하여 조사한 결과 APM-1과 FBI-1의 경우 새로운 상호작용 검색 시스템에서 얻어진 것과 동일한 결과를 보였으나 KL10 POZ domain의 homodimerization 과 다른 POZ-도메인 단백질들과의 heterodimerization 을 관찰할 수 없었다. Mammalian two-hybrid assay는 약한 상호작용의 경우 reporter 유전자가 충분히 활성화 되지 못하여 상호작용이 없는 것처럼 보이는 단점이 있으므로 GST pull-down assay를 수행하여 in vitro에서 직접적인 POZ-도메인간의 상호작용을 조사하였다.그 결과 APM-1 POZ-도메인, FBI-1 POZ-도메인, KL10 POZ-도메인 모두 세포 내에서homodimerization 및 heterodimerization을 이룸을 증명할 수 있었다. Mammalian two-hybrid assay system과 GST pull-down assay에서 얻어진 결과를 바탕으로 새로운 고속의 단백질-단백질 상호작용 검색 시스템이 매우 약한 상호작용까지 감지해낼 수 있는 민감한 방법임을 증명할 수 있었다. [영문]In the era of massive sequence information of genetic materials and proteins, development of fast and reliable method of studying protein-protein interaction is absolutely necessary. We developed a novel method that can overcome the limitations of the existing analytical methods. The new method adopted two existing systems for rapid and easy study of protein-protein interaction. To reduce time in cloning, we adopted Gateway system and developed novel destination vectors which contain YFP N-terminus (YN) or YFP C-terminus (YC) to visualize protein-protein interactions in vivo at high-speed using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technology.The newly developed method was used to investigate molecular interactions among the POZ domain regulatory proteins. We analyzed amino acids sequence homology and phylogenic relationship of virtually entire human POZ domain proteins. We selected one subgroup which includes APM-1, FBI-1, and KL10 protein for protein-protein interaction study. Through BiFC assay, we demonstrated that APM-1 POZ domain and FBI-1 POZ domain could form homodimer and form heterodimer with each other, but KL10 POZ domain could form a homodimer and heterodimer with other POZ domains weekly. We could confirm the molecular interactions by mammalian two-hybrid assay except homodimerization and heterodimerization of KL10 POZ domain. Because mammalian two-hybrid assay is difficult to detect week protein interactions, GST pull-down assay was carried out and the assay showed the direct molecular interaction among APM-1 POZ domain, FBI-1 POZ domain and KL10 POZ domain. These data suggest that our new high speed protein-protein interaction assay system is highly sensitive and efficient assay method. It may be a one of the most powerful tool to study protein-protein interactions in vivo.ope