[[alternative]]SEE1p of Saccharomyces cerevisiae : protein expression in Escherichia coli, purification and methylation activity

碩士[[abstract]]人類基因體計劃完成後，生命科學的研究慢慢從基因體學轉變到蛋白質體學的領域。蛋白質的修飾及轉錄調控成為兩個重要研究主題。蛋白質的甲基化在這兩部份佔了重要的地位，此為一種常見的轉譯後修飾行為，目前已知部分蛋白質甲基化扮演重要的細胞調控角色，然而大部分的蛋白質甲基化所產生的功能還所知有限，依然有許多蛋白質甲基化所需的轉移酶尚未找到。 對於SEE1這段不確定的酵母菌開放讀碼框(open reading frame;ORF)，假定它能在細胞質裡轉錄出一個28 kDa大小的功能性蛋白質。再經由序列的比對，我們推測它是一株S-腺苷甲硫胺酸甲基轉移脢(S -adenosyl-L-methionine methyltransferase)。 因此我們利用重組蛋白技術，將啤酒酵母菌中的SEE1基因構築到大腸桿菌(Escherichia coli ; E.coli)中並使其分別表現重組蛋白，並利用His-tag融合純化法純化出所需之重組蛋白，並以去除SEE1基因的啤酒酵母菌(簡稱ΔSEE1)為受質，以具有放射性的S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine）為輔基質來測定See1p重組蛋白之活性。並利用等電點聚焦電泳(Isoelectric Focusing electrophoresis ; IEF) 和十二基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis ; SDS–PAGE)方式分離可能受質後，以質譜儀定序出其可能受質產物。[[abstract]]As humen genome project is finished, the research of life science has changed its paradigm from genomics to proteomics gradually. The study of protein modifications and transcriptional regulation has started to dominate the research headlines. Protein methylation plays a central role in both of these fields, and it is a post-translational modification of frequent occurrence. Although in many cases the roles of protein methylation are poorly understood, some have been known to play regulatory roles in the cell. Up to now, there are still many protein methyltransferases for protein methylation that remains to be identified . The uncharacterized Saccharomyces cerevisiae open reading frame (ORF) YIL064w is predicted to encode a cytoplasmic 28 kDa protein,recognized by sequence similarity as a putative S-adenosyl-L-methionine methyltransferase. We constructed SEE1 into E. coli to express See1p . We used His-tag column to purify See1p. The protein extract from ΔSEE1 yeast strains was mixed with See1p and the cosubstrate S-adenosyl-L-methionine of which the methyl being transferred is radioactive. We used isoelectric focusing electrophoresis (IEF) and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to isolate substrates being methylated. We then used MALDI-TOF to identify the substrates.[[tableofcontents]]目錄 謝誌................................................................ I 中文摘要.......................................................... III 英文摘要............................................................ V 縮寫檢索表........................................................ VII 目錄............................................................... IX 壹、緒論............................................................ 1 一、蛋白質甲基化作用............................................ 1 二、研究動機.................................................... 1 貳、 材料與方法..................................................... 3 一、材料........................................................ 3 (一)實驗儀器................................................ 3 (二)菌株.................................................... 4 (三)質體.................................................... 4 二、方法........................................................ 5 (一) 將啤酒酵母菌中的SEE1基因構築於大腸桿菌中並使其表現重 5 組蛋白。 1.Primer的設計 ......................................... 5 2.聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction; PCR)....... 5 3.DNA瓊脂糖凝膠電泳 .................................... 6 4.PCR產物純化 .......................................... 7 5.純化產物兩端加上adenosine (補A)...................... 8 6.TA cloning............................................ 9 7.轉形作用............................................. 10 8.藍白篩選............................................. 11 9.質體萃取............................................. 11 10.限制酶酵素確認...................................... 13 (二)將SEE1基因，由pGEM-T Easy Vector構築到表現載體....... 14 pET28c中。 1.Ligation............................................. 14 (三) See1p重組蛋白質表現與純化 ............................16 1.重組蛋白質表現....................................... 16 2.小量超音波破菌(測試不同環境溫度及時間點的蛋白質量)... 17 3.超音波破菌(50ml)..................................... 19 4.His-tag 融合純化法純化重組蛋白....................... 20 (四) 測定See1p重組蛋白之其甲基轉移酶活性及分析其受質...... 22 1.酵素破菌法........................................... 22 2.放射線甲基轉移反應................................... 23 3.利用等電點聚焦蛋白質電泳(Isoelectric Focusing ....... 25 electro-phoresis; IEF)以等電點分離受質 4.利用SDS-PAGE以分子量來分離受質...................... 27 5.以質譜儀分析可能受質................................. 28 参、問題與討論..................................................... 30 1.See1p功能上的討論 ................................... 30 2.破菌方法的改變....................................... 30 3.受質的製備........................................... 31 4.See1甲基化活性與受質的討論 .......................... 31 5. His-tag 融合純化法順序的討論........................ 32 肆、結論........................................................... 34 伍、表格與圖片..................................................... 35 表一: Primer設計條件設定 ...................................... 35 表二:PCR使用材料 .............................................. 36 表三:PCR 環境條件.............................................. 36 表四: 兩端加上adenosine使用材料............................... 37 表五: TA cloning使用材料 ...................................... 37 表六: 限制脢酵素確認使用材料................................... 37 表七: 第一次用BamHI反應使用材料............................... 38 表八: 第二次用 Not1反應使用材料 ............................... 38 表九: Ligation使用材料 ( 三組比較) ............................ 38 表十: pET28c-SEE1 以限制酶BamHI 和NotI 進行確認條件........... 39 表十一: 不同環境溫度及時間點的OD600 數值 ........................ 39 表十二: 放射線甲基轉移反應原料................................. 40 圖一: PCR條件最佳溫度條件測試 ................................. 40 圖二: PCR產物純化，取5 μl sample 進行瓊膠電泳，確認片段...... 41 大小，因回收過程中會流失部分sample，故電泳亮度會淡些。 圖三:限制酶確認結果............................................ 42 圖四:使用Not1及BamHI確認pET28c vector與目標基因片段片段大小. 42 圖五: pET28c-SEE1以限制酶BamHI和NotI作用後的電泳圖 .......... 43 圖六: 圖五中取LANE 5及6再進行一次DNA瓊脂糖凝膠電泳分析確認.. 43 圖七: 收取各個時間的菌液使用超音波破菌法後跑SDS-PAGE .......... 44 24℃/24 h跑膠結果。 圖八: 24℃/24 h跑膠結果 ....................................... 44 圖九: 收取各個時間的菌液使用超音波破菌法後跑SDS-PAGE .......... 45 30℃/16 h跑膠結果。 圖十: 30℃/16 h跑膠結果 ....................................... 45 圖十一: 改採較低的培養溫度，18℃；以及加入sorbitol/betaine .... 46 18℃/48 h跑膠結果 圖十二: 18℃/48 h跑膠結果 ..................................... 46 圖十三: 24℃/48 h sorbitol..................................... 47 圖十四: His-tag純化重組蛋白See1p結果。 ....................... 47 圖十五:傳統受質製備法的SDS跑膠結果，左邊為不含sorbitol ....... 48 右邊有加入sorbitol 圖十六:傳統受質製備法的SDS跑膠後壓片結果...................... 48 圖十七:改變破菌方法並增加一組以基質做為反應酵素的對照組做...... 49 活性測試結果 圖十八: 兩組不同新鮮程度的基質比較跑膠結果..................... 49 (左為放置一個月，右為新鮮製備) 圖十九: 兩組不同新鮮程度的基質比較壓片結果..................... 50 (左為放置一個月，右為新鮮製備) 圖二十: IEF PI值3~10 跑膠結果................................. 50 圖二十一: IEF PI值3~10 壓片結果............................... 51 圖二十二: IEF pI值5~8 跑膠結果................................ 51 圖二十三: IEF pI值5~8 壓片結果................................ 52 圖二十四: 將兩種反應一起在同一塊IEF-PAGE中的不同lane ......... 52 的跑膠及壓片結果。 圖二十五: 三個高度的band都切下並區分為cold1、cold2、cold3、 .. 53 hot1、hot2、hot3六條SDS stripe。 圖二十六: 將IEF膠片上三個高度的band都切下並區分為cold1、 .... 53 cold2、cold3、hot1、hot2、hot3六條SDS stripe。 圖二十七: 將IEF膠片上三個高度的band都切下並區分為cold1、 .... 54 cold2、cold3、hot1、hot2、hot3六條SDS stripe的壓片結果 圖二十八:在SEE1之後純化的pET28c純化物實驗控制組.............. 54 圖二十九: 改變破菌方法後的跑膠壓片結果......................... 55 圖三十: 重複傳統玻璃珠破菌製備基質的實驗，菌液的OD600值控..... 55 制在0.3及0.6。左為0.3右0.6 圖三十一: 重複傳統玻璃珠破菌製備基質的實驗，菌液的OD600值..... 56 控制在0.3及0.6。左為0.3右0.6 圖三十二: 基質在OD600值0. 3及0.6下分別使用玻璃珠及酵素破菌的 56 方式。再經由軟體做定量分析 圖三十三: SEE1送台大醫學院第二研究室定序結果 .................. 57 陸、參考文獻....................................................... 58[[note]]學號: 697180270, 學年度: 9