以大腸桿菌表達系統生產雙功能基因重組熱穩定型Clostridium thermosulfurogenes β-澱粉酶及Picrophilus torridus 海藻醣合成酶之融合酵素及其催化甘藷澱粉單一步驟轉化海藻糖反應

Trehalose is a novel multi-functional disaccharide. It serves a variety of functions in organisms and protects organisms to survive harsh environments. In addition, it can be a sweetener, and be a useful compound to preserve biomaterials in the food, cosmetic, and pharmaceutical industries by its ability of stabilizing macromolecules. The most economical pathway for trehalose production is a reversible conversion of maltose into trehalose by trehalose synthase (TSase). In this study, we developed a new bifunctional gene combined with a recombination gene from a thermophilic Clostridium thermosulfurogenes β-amylase and a thermophilic TSase (PTTS#N503P) which was synthesized using overlap extension PCR and expressed in Escherichia coli system to express the active fusion enzymes. Our aims were focused on the directly converted of starch into trehalose in one-step by the recombinant fusion enzyme (PTTS#N503P-CTBA). Since the reaction temperature was increased to 60 °C, the novel PTTS#N503P-CTBA fusion enzymes represented 2-fold higher catalytic efficiency than that of PTTS#N503P enzymes. Also, the optimal reaction temperature of recombinant fusion enzyme was changed. The combination of TSase (PTTS#N503P) and thermophilic β-amylase resulted in a broad pH range of 5.0-7.0 with high enzyme activity. For enzyme thermodynamics result, the PTTS#N503P-CTBA represented slightly higher half-life time than that obtained by PTTS#N503P at 60 °C. For the effect of various metal ions, higher concentration (10 mM) of Cesiurn and Magnesiurn could help to stabilize the enzyme with higher catalytic activity. Overally, our novel fusion enzyme (PTTS#N503P-CTBA) is more thermostable and acid-resistant than the wild type. Since it can be used as a functional biocatalyst to directly convert maltose into high value-added of trehalose in one-step accompany with lower cost, we believe it will be another highly potential and useful choice for further industrial applications.海藻糖(Trehalose) 是新一代崛起的多功能醣類，存在於自然界的許多物種內，其在生物體內的功用除了可作為儲備能源與碳源外，還能幫助生物抵抗惡劣環境。海藻糖的應用範圍很廣，除了當作甜味劑外，因其具有穩定生物巨分子的能力，所以也可用來幫助保存食品、化妝品或是醫藥材料。海藻糖合成酶是生物體內用來生成海藻糖的一種途徑，能直接將麥芽糖轉化成海藻糖。 本研究使用PCR方式擴增一耐熱型Clostridium thermosulfurogenes β-澱粉酶(β-amylase)之DNA片段，再將先前選殖出之耐熱型海藻糖合成酶(PTTS#N503P)進行基因重組得到一全新的融合基因片段，並於大腸桿菌(Escherichia coli)系統中進行蛋白質之大量表達，以取得具有活性之雙功能融合酵素：PTTS#N503P -CTBA。藉由此酵素之開發，可單一步驟的催化澱粉直接轉換成海藻糖，利用overlap extension PCR方式合成並在大腸桿菌中大量表達之基因重組酵素，尾端接有六個組胺酸 (Histidine)幫助純化。 全新的PTTS#N503P–CTBA融合基因所表現出之蛋白質，當溫度達到60 ℃時，PTTS#N503P-CTBA酵素仍可維持比PTTS#N503P至少高出2倍的相對活性，有效提昇基因重組酵素可應用之溫度範圍；經由β-amlyase的接合後，其可作用的pH穩定性範圍已從5.0-6.0轉變成5.0-7.0，使基因重組酵素可應用的pH值範圍更廣泛；在酵素熱穩定性測試方面，PTTS#N503P–CTBA也比PTTS#N503P具有較長的半衰期；就金屬離子試劑之影響方面，結果顯示，當Cs+與Mg2+的濃度達10 mM時，對於酵素之活性具有顯著的穩定效果。本研究發現之新型海藻糖合成酶因同時具有耐熱與耐酸的能力，且可直接將澱粉轉化為高經濟價值海藻糖，不但有效簡化生產製程，且可降低生產成本，相信其在未來工業生產方面將具有極大的發展潛力。中文摘要.................................................. і Abstract................................................. ii 第一章 前言 ...............................................1 第二章 文獻回顧............................................2 一、海藻糖 ................................................2 (一) 海藻糖簡史 ...........................................2 (二) 海藻糖的物理及化學特性 ...............................2 (三) 海藻糖的功能 .........................................2 (四) 海藻糖的應用 .........................................5 (五) 海藻糖的製造 .........................................6 (六) 海藻糖的酵素生合成途徑 ..............................10 (七) 海藻糖合成酶 ........................................11 第三章 研究目的 ..........................................17 第四章 材料與方法 ........................................19 一、實驗材料 .............................................19 (一) 原料 ................................................19 (二) 質體與菌種 ..........................................19 (三) 基因 ................................................19 (四) 培養基 ..............................................19 (五) 抗生素 ..............................................22 (六) 酵素 ................................................22 (七) 化學試劑與藥品 ......................................22 二、儀器設備 .............................................22 三、套裝軟體 .............................................22 四、實驗流程 .............................................24 五、實驗方法 .............................................25 (一) 基因重組PTTS#N503P-CTBA .............................25 (二) DNA Gel Extraction ..................................25 (三) 質體(Plasmid)的抽取 .................................25 (四) 勝任細胞(Competent cell)製備.........................27 (五) 細胞轉型作用 ........................................27 (六) 蛋白質純化 ..........................................28 (七) 聚丙烯醯胺膠體電泳 ..................................28 (八) 蛋白質定量 ..........................................29 (九) 酵素分析 ............................................30 (十) 糖類分析 ............................................32 第五章 結果與討論 ........................................34 一、PTTS#N503P-CTBA酵素在大腸桿菌宿主中的表現與純化 ......34 二、PTTS#N503P-CTBA酵素的反應時間 ........................34 三、PTTS#N503P-CTBA酵素的生化特性分析 ....................34 (一) 最適作用溫度與熱穩定性評估 ..........................34 (二) 最適作用pH與pH穩定性測試討 ..........................42 (三) 金屬離子與化學試劑對酵素的影響 ......................46 第六章 結論 ..............................................48 第七章 參考文獻 ..........................................49 表目次 表一、海藻糖的特性 ........................................4 表二、不同來源之海藻糖生成酶生化特性 .....................14 表三、大腸桿菌菌株特性 ...................................21 表四、PTTS#N503P–CTBA蛋白質之純化表 .....................39 表五、金屬離子及化學試劑對PTTS#N503P-CTBA活性的影響 ......47 圖目次 圖一、自然界存在之海藻糖異構物，α,α1,1-trehalose ........3 圖二、澱粉水解酵素種類 ....................................8 圖三、海藻糖之三種生合成途徑 .............................12 圖四、以MTSase及MTHase生產海藻糖流程圖 ...................13 圖五、3種海藻糖合成酶之胺基酸序列比對 ....................16 圖六、圖示重組酵素PTTS#N503P-CTBA催化澱粉轉化海藻糖反應 ..18 圖七、pET-23a(+)載體圖譜 ..........................................................20 圖八、圖示重組DNAs PTTS#N503P、CTBA及PTTS#N503P-CTBA嵌入pET-23a(+) ...................................................26 圖九、高效能液相層析儀醣類分析結果圖 .....................33 圖十、質體構築流程圖 .....................................35 圖十一、PTTS#N503P–CTBA基因之DNA序列 ....................36 圖十二、基因重組PTTS#N503P–CTBA之胺基酸序列 .............38 圖十三、不同反應時間對基因重組PTTS#N503P-CTBA催化海藻糖產量之影響 ...................................................40 圖十四、不同反應溫度對PTTS#N503P–CTBA與PTTS#N503P活性的影響 .......................................................41 圖十五、不同預培養溫度對PTTS#N503P–CTBA與PTTS#N503P穩定性的影響 .....................................................43 圖十六、不同pH值對PTTS#N503P –CTBA及PTTS#N503P活性的影響.44 圖十七、不同預培養pH值對PTTS#N503P–CTBA及PTTS#N503P穩定性的影響 .....................................................4