Underlying Mechanisms of Prolyl Oligopeptidase Inhibition, Deletion, and Restoration on the α-Synuclein Aggregation Process

Neurodegenerative disorders are characterized by accumulation of toxic protein species that are followed by a gradual loss of neurons in certain brain regions and person’s loss of movement and dementia. The cause of the protein accumulation is not fully understood but is partially influenced by the disturbances in the protein degradation pathways, post-translational protein modifications that facilitate either gain-of-toxicity or loss-of-function of these proteins. In Parkinson’s disease, the best-known aggregation prone protein is alpha-synuclein (aSyn) that is the main component of Lewy bodies, the histopathological hallmarks of Parkinson’s disease and other synucleinopathies. Several studies suggest that aSyn aggregates can damage neurons by various mechanisms, and propagate toxicity by cell-to-cell transfer thus making it a tempting target for drug therapy. Current drug therapies can only relieve symptoms of neurodegenerative diseases but do not address, for example, protein aggregate clearance or pharmacological deceleration of the inclusion formation. In previous studies, prolyl oligopeptidase (PREP) has been shown to enhance the aggregation of aSyn. PREP inhibitors have been shown to reduce the aggregation and increase the clearance of aggregates via enhanced autophagy. However, the mechanisms of how PREP affects aSyn aggregation and regulates autophagy, and if this has a long-term impact on aSyn toxicity, have not been studied. The aim of this study was to investigate the role of PREP deletion, restoration, overexpression, and catalytical inhibition on the cellular signaling pathways and aSyn aggregation. The first part of the work was done in PREP knockout cells and knockout mice where the aSyn protein was overexpressed alone or together with PREP. We showed that absence of PREP decreases aSyn-overexpression mediated behavioral and cellular toxicity in mouse brain. Additionally, we found that PREP knockout cells exhibit reduced stress response and toxicity in the presence of protein overload, have increased autophagic activity, and remove excess aSyn into the cell media. The second part studied effects of chronic PREP inhibition by KYP-2047 on aSyn aggregation and on motor disturbances in the aSyn viral vector overexpression PD mouse model. The main finding showed that after chronic PREP inhibition, animals lost pathological unilateral motor behavior due to reduction in aSyn oligomer species in the nigrostriatal pathway. The third part concentrated on mapping the role of PREP in the pathways responsible for the autophagy initiation. The main finding was discovery of PREP’s role in negatively regulating one of the most important protein phosphatase complexes, protein phosphatase 2A (PP2A), via direct protein-protein interaction. Besides, this interaction could be altered with PREP inhibitor treatment that resulted in upregulation of PP2A activity and explained the functional results of autophagy induction after PREP inhibition. In summary, the findings of this study underline mechanisms through which PREP might be mediating aSyn related pathology and underlines the potential of PREP inhibition as an attractive drug target in reducing aSyn aggregate formation and boosting clearance from the affected brains. PREP involvement in the PP2A network regulation and additional functional data warrants further PREP investigation in the context of other neurodegenerative disorders and PP2A-related ailments.Hermostoa rappeuttavat sairaudet, kuten Parkinsonin ja Alzheimerin tauti, koskettavat yhä suurempaa joukkoa ihmisiä väestön ikääntymisen myötä. Näissä sairauksissa eri aivoalueilla tapahtuu huomattavaa hermosolukatoa, joka johtaa näkyviin oireisiin, kuten Parkinsonin taudissa liikehäiriöihin ja Alzheimerin taudissa muistin häiriöihin. Hermosolukato myös etenee jatkuvasti, ja oireet vaikeutuvat ja lisääntyvät tämän myötä. Nykyiset hoidot eivät kykene pysäyttämään tai edes hidastamaan hermosolutuhoa, joten uusien lääkevaikutuskohteiden ja taudin kulkua muuttavien hoitojen tutkiminen on erittäin tärkeää. Suurin ongelma uusien hoitojen kehittämisessä on ollut se, etteivät hermosolujen tuhoutumisen syyt ole vieläkään kovin hyvin selvillä. Kuitenkin yksi tärkeimmistä tekijöistä näyttää olevan tiettyjen hermosolujen sisäisten proteiinien muuntuminen virheelliseen muotoon ja tästä seuraava kertyminen hermosoluihin. Näiden kertymien olemassaolo esim. Parkinsonin taudin potilaiden aivonäytteissä on tunnettu jo pitkään, mutta vasta viimeisen kahden vuosikymmenen aikana on havaittu, että nämä ovat muodostuessaan myrkyllisiä hermosoluille ja voivat jopa levittää hermosolutuhoa solusta soluun liikkuessaan. Tämän vuoksi proteiinikertymät ovat nousseet keskeisiksi lääkekehityskohteiksi hermostoa rappeuttavissa sairauksissa. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin, miten prolyylioligopeptidaasi (PREP)-entsyymi vaikuttaa erityisesti Parkinsonin taudissa keskeisen alfa-synukleiini-proteiinin (a-synukleiini) kertymiseen ja myrkyllisyyteen. PREP:iä on tutkittu jo 1980-luvulta lähtien hermostoa rappeuttavien sairauksien parissa, mutta vasta 10 vuotta sitten havaittiin, että se voi lisätä a-synukleiinin kertymistä. Tämän jälkeen Helsingin yliopistossa toimiva dosentti Timo Myöhäsen ryhmä on havainnut, että PREP-estäjät voivat vähentää a-synukleiinin kertymistä Parkinsonin taudin solu- ja eläinmalleissa, ja tämän pohjalta väitöskirjaprojektissa keskityttiin seuraaviin kysymyksiin; 1) Miten merkittävä PREP on a-synukleiinin kertymiselle, 2) voidaanko PREP-estäjillä hoitaa a-synukleeinin aiheuttamaa liikehäiriötä eläinallissa ja 3) mihin tämä vaikutus perustuu? Tutkimuksessa havaittiin, että PREP ei ole välttämätön tekijä a-synukleiinin kertymiselle, mutta se lisää erityisesti kaikista myrkyllisimpien a-synukleiini-muotojen määrää, ja vaikuttaa tätä kautta huomattavasti a-synukleiinin myrkyllisyyteen. Jatkotutkimuksessa haluttiin selvittää, voidaanko PREP-estäjää käyttämällä vaikuttaa Parkinsonin taudin eläinmallin liikehäiriöön. Tätä varten pystytettiin a-synukleiinin ylimäärään perustuva hiirimalli, jota alettiin hoitaa PREP-estäjällä liikehäiriöoireiden ilmaannuttua. PREP-estäjä vaikutti jo 2 viikon kuluttua hoidon aloittamisesta niin, että Parkinson-hiirelle syntynyt liikehäiriö palautui normaalin hiiren tasolle, ja kudosanalyysissa havaittiin a-synukleiinikappaleiden selvästi vähentyneen hoidon myötä. Vaikutuksen takana oli PREP-estäjän kyky estää a-synukleiinin kertymistapahtumaa sekä lisätä jo syntyneiden kertymien hajotusta solujen ”kierrätyskeskuksen”, autofagian, kautta. Projektin viimeisessä osassa haluttiin selvittää miten PREP vaikuttaa solujen kierrätyskeskuksen toimintaan, ja tässä selvisi että PREP säätelee erittäin tärkeää solun toiminnan säätelijää, proteiinifosfataasi 2A:ta. Tutkimuksessa selvisi myös, että PREP-estäjillä tämä fosfataasi voidaan aktivoida, mikä lisää huomattavasti PREP-estäjien mahdollisuuksia, sillä proteiinifosfataasi 2A:n toiminnan häiriöt on yhdistetty mm. Parkinsonin ja Alzheimerin tauteihin sekä useisiin syöpiin. Väitöstutkimus osoitti selvästi, että PREP ja PREP-estäjät ovat lupaavia lääkekehityskohteita Parkinsonin tautiin, mutta lisäksi projektissa paljastui, että PREP:illä on potentiaalia myös usean muun sairauden lääkekehityskohteena