Biosfera Profunda: Populações Microbianas como fonte de Soluções Biotecnológicas

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaAtualmente, acredita-se que os organismos que constituem maioritariamente a biosfera na Terra, os microrganismos, se encontram em elevada percentagem na biosfera de profundidade. Este termo é referente ao conjunto de habitats que se localizam abaixo da superfície dos continentes e do fundo dos oceanos e englobam microrganismos que podem ser utilizados para o estudo de estratégias de sobrevivência em condições extremas. No entanto, em escassas situações é possível simular todas as condições necessárias ao cultivo destes extremófilos em ambiente laboratorial e, por este motivo, a maioria destes microrganismos permanece por cultivar – designando-se por “microbial dark matter”. A nascente de Alfaguara, localizada nos Peridotitos de Ronda, no sul de Espanha, está associada a um aquífero de profundidade gerado por reações de serpentinização. Com o objetivo de perceber qual a diversidade estrutural das populações bacterianas aeróbias heterotróficas presentes neste habitat, uma série de métodos dependentes de cultivo foi aplicada. Posteriormente, os isolados foram agrupados por perfil de RAPD, o(s) isolado(s) representativo(s) de cada grupo foram sumariamente caracterizados e sua filogenia foi determinada pela sequenciação do gene 16S rRNA. Com esta análise, determinou-se que a maioria dos isolados pertenciam ao filo Firmicutes, nomeadamente ao género Bacillus. Outros pertenciam ao filo Actinobacteria, sendo mais relacionados com espécies dos géneros Microbacterium, Micrococcus e Kocuria. O potencial biotecnológico dos isolados também foi avaliado ao determinar a sua capacidade para degradar quitina, carboximetilcelulose, xilano e amido. Nenhum dos isolados testados degradou quitina, no entanto, todos os isolados apresentaram actividade de degradação positiva para pelo menos um dos outros três substratos testados. Alguns deles exibiram essa atividade a valores de pH mais elevados. Além disso, a principal atividade de degradação foi obtida para xilano.Para determinar a diversidade estrutural o mais aprofundada possível, métodos independentes de cultivo, nomeadamente a plataforma de sequenciação massiva Illumina, foram aplicados. O género aeróbio facultativo Hydrogenophaga/Serpentinomonas, comumente identificado neste tipo de ambientes, foi identificado como sendo o mais abundante na comunidade bacteriana, mas a classe Clostridia, associada a microrganismos estritamente anaeróbios também se mostrou bastante representada. Os géneros aeróbios Candidatus nitrocosmicus e Candidatus nitrosoarchaeum, foram o grupo de archaeas maioritariamente identificados. No entanto, apesar da sua abundância, estes grupos de archaeas não são normalmente encontrados em ecossistemas associados a serpentinização, tornando a comunidade de archaeas de Alfaguara distinta das já conhecidas e descritas na literatura.Microorganisms constitute a large portion of the biosphere on Earth and part of them is present in the deep biosphere: a set of habitats physically located below the surface of continents and/or the bottom of the ocean. Microorganisms living in these environments can be a leverage to better understand strategies of survival/growth in extreme conditions; however, only a small percentage can be recovered and cultured on laboratory conditions. The set of microbial organisms that remains uncultured comprises the “microbial dark matter”.Alfaguara spring is a deep aquifer hyperalkaline spring, associated with serpentinization reactions, located at Peridotites of Ronda, South of Spain. To access the diversity of the aerobic heterotrophic bacteria present in this habitat, an extensive culture-dependent isolation process was conducted. Isolates were grouped by RAPD profiling, representative isolate(s) of each group were summarily characterized, and its phylogenetic placement was determined by 16S rRNA gene sequencing. The vast majority of the isolates were phylogenetically related to the phylum Firmicutes, namely with genus Bacillus. Others were related to phylum Actinobacteria, specifically with species belonging to genera Microbacterium, Micrococcus and Kocuria. The biotechnological potential of the isolates was accessed by screening their ability to degrade chitin, carboxymethyl cellulose, xylan and starch. All isolates were successful in the degradation of at least one of the substrates and some of them showed that ability at higher pH values. The major degradation activity (either by activity and number of isolates) was obtained for xylan. None of the isolates degraded chitin. The structural microbial diversity was also accessed by culture-independent methods, namely metagenomic 16S rDNA Illumina tags. Hydrogenophaga/Serpentinomonas was the most abundant genus found in the Alfaguara community, a common population found in this kind of environments. In addition, members of Clostridia, a class of strictly anaerobe microorganisms was also rather abundant. Moreover, Candidatus nitrocosmicus and Candidatus nitrosoarchaeum were the major archaeal populations detected. Despite their abundance, these two groups of aerobic archaea are not normally found at sites associated with serpentinization, making the Alfaguara deep aquifer community distinct from those already known.Outro - Projeto de Investigação Exploratória IF/01061/201