Complement Receptor 3 and its role in the interaction of primary human macrophages with apoptotic Leishmania major promastigotes

Leishmania parasites are the causative agent of the neglected tropical disease leishmaniasis. The sand fly vector-borne, disease-initiating Leishmania promastigote life stage (Lm) is comprised of viable and apoptotic parasites. Targeting of the latter by LC3-associated phagocytosis (LAP) leads to a decreased activation of the adaptive immune system. Based on these findings, this study focuses on (1) the internalization of apoptotic Lm by human monocyte-derived pro- (hMDM1) and anti-inflammatory (hMDM2) macrophages, (2) evasion of viable Lm from degradation as well as (3) identification and (4) functional characterization of factors that lead to uptake of apoptotic Lm and LAP induction. For detailed analysis of the apoptotic Lm population we separated viable from apoptotic Lm. Phagocytosis assays by flow cytometry in which hMDMs were differentially infected with viable or apoptotic Lm showed that hMDMs ingested apoptotic Lm more rapidly than viable parasites. Investigations of supernatants from differentially infected hMDMs and hMDDCs by ELISA revealed not only a higher release of the anti-inflammatory cytokine IL-10 but also an increase in secretion of the pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and IL-8 in presence of apoptotic Lm. Live cell microscopy showed that LAP can be triggered by viable and apoptotic Lm. Phagosomes harboring apoptotic parasites were targeted more frequently and more rapidly by eGFP-LC3 in hMDM2 as compared to phagosomes containing viable parasites. To identify factors that initiate apoptotic parasite internalization and LC3 recruitment, magnetic isolation of apoptotic Lm-containing phagosomes was performed. Subsequent mass spectrometry and data analysis revealed the phagocytic receptors low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (CD91) and Complement Receptor 3 (CR3) to be highly abundant in phagosomes harboring apoptotic Lm. Blocking of CD91 with a monoclonal antibody was not efficient and knockdown of CD91 with siRNA did not affect uptake of Lm, but the interaction still might be relevant and should be investigated in more detail. Inhibition of CR3 with a functional antibody significantly reduced uptake of apoptotic Lm by hMDMs. This receptor blocking in turn resulted in a decreased production of pro-inflammatory TNF-α by hMDM1 and a significantly diminished IL-10 secretion by hMDM2. Inhibition of CR3 strikingly reduced LC3 lipidation as a measure for LAP induction in hMDM2 challenged with apoptotic or stationary phase Lm. Intriguingly, decreased internalization of apoptotic Lm neither resulted in a higher T cell proliferation nor in an increased survival of viable Lm within hMDMs. In conclusion, the data for the first time describe CR3 to play a significant role in the interaction of hMDM2 with especially apoptotic Lm and indicate a role of the receptor in LAP. Control of receptor-mediated internalization and LAP of apoptotic Lm could serve as a novel therapeutic approach to combat the neglected tropical disease leishmaniasis.Parasiten der Gattung Leishmania sind die Erreger der vernachlässigten Tropenkrankheit Leishmaniose. Das durch einen Sandfliegenvektor übertragene promastigote Lebensstadium der Leishmanien (Lm) umfasst lebendige als auch apoptotische Parasiten. Aufnahme der Letzteren durch LC3-assoziierte Phagozytose (LAP) führt zu einer verminderten Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Basierend auf diesen Erkenntnissen konzentriert sich die vorliegende Studie auf (1) die Internalisierung von apoptotischen Lm durch primäre, humane pro- (hMDM1) und anti-inflammatorische (hMDM2) Makrophagen, (2) das Entkommen der lebendigen Parasiten vor der Degradation in der Zelle sowie (3) die Identifizierung und (4) funktionelle Charakterisierung von Faktoren, die zur Aufnahme der apoptotischen Lm und einer Induktion von LAP führen. Für eine detaillierte Analyse der apoptotischen Parasiten wurden diese von lebendigen Lm getrennt. Phagozytose-Assays mittels Durchflusszytometrie zeigten, dass nach differenzieller Infektion von hMDMs mit apoptotischen und lebendigen Lm die Aufnahme apoptotischer Lm schneller erfolgte als die Aufnahme lebendiger Parasiten. Untersuchungen von Zellüberständen differentiell infizierter hMDMs und hMDDCs mittels ELISA zeigten nicht nur eine erhöhte Freisetzung des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10, sondern auch eine Erhöhung der Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6 und IL-8 durch hMDMs in Gegenwart von apoptotischen Lm. Die Analyse der LAP von Lm mittels Lebendzell-Mikroskopie ergab, dass eGFP-LC3 in hMDM2 in größerem Maße und schneller zu Phagosomen rekrutiert wurde, die apoptotische Parasiten beinhalteten, als zu Phagosomen, die lebendige Parasiten enthielten. Um Faktoren zu identifizieren, die die Internalisierung der apoptotischen Parasiten und die Rekrutierung von LC3 auslösen, wurde eine magnetische Isolierung von apoptotischen Lm-enthaltenden Phagosomen durchgeführt. Markierungsfreie Massenspektrometrie und eine anschließende Datenanalyse zeigten, dass die Phagozytoserezeptoren Lipoprotein receptor-related protein 1 (CD91) und Complement Receptor 3 (CR3), in Phagosomen mit apoptotischem Lm in großer Zahl vorhanden waren. Die Blockierung von CD91 mit einem monoklonalen Antikörper war nicht effizient und auch der Knockdown des Rezeptors hatte keinen Einfluss auf die Wechselwirkung mit Lm. Die Inhibierung von CR3 mit einem funktionellen Antikörper hingegen reduzierte signifikant die Wechselwirkung von hMDMs mit apoptotischem Lm. Diese Blockierung des Rezeptors führte wiederum zu einer verminderten Produktion von pro-inflammatorischem TNF-α durch hMDM1 und einer signifikant verminderten anti-inflammatorischen IL-10-Sekretion durch hMDM2. Zusätzlich verringerte die Inhibierung von CR3 die LC3-Konversion in hMDM2, welche mit apoptotischen oder stationäre Phase-Lm inkubiert wurden. Interessanterweise führte eine verringerte Internalisierung von apoptotischen Lm weder zu einer höheren T-Zell-Proliferation noch zu einem erhöhten Überleben lebendiger Lm in infizierten hMDMs. Zusammenfassend zeigen diese Daten zum ersten Mal, dass Complement Receptor 3 eine signifikante Rolle in der Wechselwirkung von hMDM2 mit apoptotischen Lm spielt und lassen zudem auf eine Rolle des Rezeptors in LAP schließen. Rezeptor-vermittelte Internalisierung und LAP von apoptotischen Lm könnte als neuer therapeutischer Ansatz zur Bekämpfung der vernachlässigten Tropenkrankheit Leishmaniose dienen