Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung von Spike, einem neuen BH3-Domänen Protein

During my PhD thesis I was working on the identification of novel apoptosis-inducing genes by using a novel genetic expression screen (Grimm and Leder, 1997). One of the identified genes turned out to be a evolutionary conserved cDNA that codes for a novel BH3-only protein of 219 amino acid residues which was named Spike, for Small protein with inherent killing effect. Spike was then in the course of my PhD thesis extensively characterised, molecularly and biochemically. In summary, upon overexpression in mammalian cells Spike efficiently leads to all features of apoptosis, such as phenotypic alterations, cytochrome c release, caspase activation and DNA degradation. It was shown that Spike localised to the endoplasmic reticulum, where it interacts with a recently identified apoptosis regulating protein complex, consisting of Bap31, Bcl-2, Bcl-XL and an ER-specific isoform of caspase-8: pro-caspase 8L (Breckenridge et al. 2002). Although no direct interaction with anti-apoptotic members of the Bcl2-family could be observed, the importance of the BH3-like sequence for the apoptosis-inducing activity of Spike was demonstrated by using point mutations of conserved amino acid residues of this motif (Mund et al. 2003). Instead of directly interacting with anti-apoptotic members of the Bcl-2 family Spike is able to interfere with the complex formation between Bap31 and Bcl-XL. Based on these data I proposed a model according to which the complex on Bap31 is controlled by Bcl-2/Bcl-XL as long as they are associated. Displacement of Bcl-2/Bcl-XL from Bap31 by Spike leads to the formation of a pro-apoptotic complex. In addition, Spike appears to be implicated in the cell death signal of the Fas receptor. I observed that a dominant-negative version of Spike and a highly effective anti-sense oligonucleotide significantly reduced Fas-mediated DNA fragmentation whereas no reduction was detected in TNFa-induced cell death (Mund et al. 2003).Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine bislang nicht genauer beschriebene cDNA biochemisch und molekularbiologisch genauer charakterisiert, die mit Hilfe eines speziell zur Identifikation dominanter, Apoptose-induzierender Gene entwickelten genetischen Expressionsscreens detektiert wurde (Grimm und Leder, 1997). Der ORF kodiert für ein unbekanntes BH3-only-Protein von 219 Aminosäureresten (Spike), das in humanen Zellen schnell und effizient Apoptose induzieren kann. Die Apoptose-induzierende Funktion von Spike greift vermutlich auf einen evolutiv konservierten Mechanismus zurück, da auch die homologen C. elegans– und D. melanogaster–Proteine nach transienter Transfektion in Säugerzellen deren Tod verursachen. Dabei induziert Spike Caspase-abhängige Apoptosewege. Nach der Hemmung Caspase-vermittelter Merkmale wie die Bildung apoptotischer Körperchen (membrane blebbing), DNA-Fragmentierung oder Caspase-3-Aktivierung mit zVADfmk, wird außerdem die Ausprägung eines Caspase-unabhängig initiierten Phänotyps deutlich. Zusätzlich aktiviert Spike proapoptotische mitochondriale Ereignisse, es kommt zu einer Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials und zum Austritt von Cytochrome c. Spike wird in den meisten der getesteten Gewebe und Zelltypen exprimiert, obwohl die Expressionsstärke sehr stark variiert. Im Northern-Blot konnten vergleichsweise hohe Expressionslevel an Spike-mRNA in Niere, Placenta, Herz und Leber detektiert werden, kein Signal wurde in peripheren Blut-Leukozyten deutlich. Das breite Expressiosspektrum unterstreicht das Potenzial von Spike, als genereller Apoptoseregulator zu wirken und läßt eine Regulation der Spike-Aktivität auf posttranslationeller Ebene vermuten. Unterstützt wird diese Vermutung durch das Auftreten eines 33 kD-Signals in Immunoblot-Analysen, welches in seiner Intensitätsstärke zu p31 in Abhängigkeit vom Zelltyp variiert. Die N-terminalen 19 Aminosäurereste sind für die subzelluläre Verteilung von Spike am ER verantworlich, die zwei coiled-coil-Domänen in der Spike-Sequenz vermitteln dessen Selbstassoziation. Das BH3-Motiv ist für die proapoptotische Aktivität von Spike notwendig. Die Deletion dieses Motivs bzw. Punktmutationen konservierter Reste reduzieren drastisch die Zelltod-induzierende Wirkung von Spike. Obwohl die BH3-Domäne notwendig für die proapoptotische Aktivität ist, wurde im Gegensatz zu anderen BH3-only-Proteinen keine Assoziation von Spike mit den antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie Bcl-2 oder Bcl-XL detektiert. Spike könnte wie Bok selektiv nur mit bestimmten (hier nicht getesteten) Bcl-2-Mitgliedern interagieren. Spike interagiert mit Bap31, welches am ER einen Proteinkomplex bildet, der Procaspase-8L sowie die antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie Bcl-2 bzw. Bcl-XL enthält. Die Spike-vermittelte Apoptose beinhaltet eine Caspase-abhängige Prozessierung von Bap31, was indirekt eine Aktivierung von Procaspase-8L hindeutet. Die Assoziation von Spike mit Bap31 reduziert drastisch eine gleichzeitige Interaktion von Bcl-XL mit Bap31. Dies führte zur Postulierung eines Modells, wonach eine Aktivierung von Spike auf einen spezifischen Apoptosestimulus hin zu einer Verdrängung von Bcl-XL am Bap31-Komplex führt, das diesen Komplex in einem inaktiven Zustand gehalten hatte. Da jedoch diese Verdrängung unabhängig vom BH3-Motiv stattfindet, aber ein Großteil der Apoptose-induzierenden Aktivität durch diese Domäne vermittelt wird, kommt es möglicherweise zur BH3-abhängigen Aktivierung eines „Faktor X“, der das auf molekularer Ebene bisher nicht identifizierte Bindeglied zwischen Endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien darstellen könnte. Spike ist in HeLa-Zellen an der Fas-induzierten, nicht jedoch an der TNFa-vermittelten Apoptose beteiligt, wie mit Hilfe eines dominant-negativ wirkenden Spike-Konstruktes (DN19) und eines Antisense-Oligonukleotids gegen Spike nachgewiesen wurde. Zusätzlich konnte eine signifikante, tumorspezifische Reduktion des Spike-Signals in spezifischen Tumoren beobachtet werden, welches in einer verringerten Sensitivität der Zellen auf extrazelluläre Todessignale wie Fas resultiert und somit zu einer Förderung, des Tumorwachstums beitragen kann