Untersuchungen zu den Interaktionspartnern modifizierter Nukleoside in messenger RNA

The central dogma of molecular biology describes the transfer of genetic information through the three essential layers DNA, messenger RNA and protein. Regulation of gene expression takes place during each individual step and is considered epigenetic when it includes inheritable modulation of genetic information by reversible chemical modification of the information carriers. The existence of this form of regulation is established on the levels of DNA and protein. In stark contrast, epigenetic regulation on the level of messenger RNA is an underdeveloped field of research that lately experienced a strong increase in scientific interest and number of publications. Recent work addressing the biological function and sequence context of N6-methyladenosine, N1-methyladenosine and pseudouridine hints towards actively modulated mRNA modification patterns that represent a formerly unknown network of epigenetic regulation. In addition to a detailed analysis of the sequence context of such nucleoside derivatives, the knowledge of their protein interaction partners is an essential step towards a deeper understanding of their biological function. In this work, interactome studies for a number of RNA modifications were performed, to better understand the described regulatory networks. For this purpose N6-methyladenosine (m6A), N6,N6-dimethyladenosine (m62A), pseudouridine (Ψ), N6-isopentenyl-2-methyl- thioadenosine (ms2i6A), N6-isopentenyladenosine and the four 2’-O-methylated nucleosides Am, Gm, Cm and Um (Figure 1) were incorporated into oligoribonucleotides, using solid phase synthesis. In the case of i6A, ms2i6A, m6A and m62A, this required synthesis of the phosporamdites 15, 22, 29 and 31. In a cooperative effort with the group of Michiel Vermeulen, the synthesized strands were used for interactome studies utilizing stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC). In these studies, groups of proteins that specifically interact with the modifications of interest (reader proteins), but also networks of repelled proteins that show preferential binding to the unmodified control strands, could be identified. For m6A, undoubtedly the “epicenter” of mRNA epigenetics, a number of formerly unknown readers were observed. Among them are FMR1, FXR1 and FXR2, proteins that are functionally related to the fragile-X-syndrome, a major cause of inheritable mental retardation. The characteristic phenotype results from a loss in RNA-binding activity of FMR1 and the newly discovered connection between the RNA modification m6A and the binding behavior of the central proteins illuminates a highly interesting novel mechanistic detail of these critical RNA-protein interactions. In addition to these readers, the negative interactome of repelled proteins was characterized for the first time. It shows a comparably high degree of variability, depending on the sequence context of the modification and is a rich source for future studies. For the G3BP1 and G3BP2 pair of repelled proteins, a selective interaction with unmodified sequences was validated. Furthermore, their stabilizing effect on bound transcripts was demonstrated which shows that they functionally antagonize m6A-binders of the YTH-family that destabilize mRNA. Figure 2 is a short graphical summary of the findings regarding this modification. The group of ribose-methylated nucleosides (Am, Cm, Um and Gm) was found to interact with a highly complex set of proteins that appears to be specific for the individual nucleobases. An involvement of the Nm group in an interferon response to viral infections has been published previously and the results of the investigations presented herein suggest that Um is the modification that mediates this involvement. Aside from this, the repellence of nucleolytically active complexes and interactions with splicing regulators appear to be features of the group. The fact that Gm strongly repels the YTHDF family of proteins implies an antagonism between m6A and Gm that warrants further investigation, since this would enable a previously unknown mechanism of fine-tuning the m6A interactome. The results are summarized in figure 3. The mRNA hypermodification ms2i6A was another key focus of this thesis, being an unusually complex mRNA modification. To further investigate the biological function of the modification, interactome studies were conducted and a knockout cell line of the biosynthetic enzyme, CDK5RAP1, was characterized. The analysis, combining deep transcriptomics with an analysis of the whole cellular proteome (figure 4), shows that the absence of ms2i6A leads to a general defect in mitochondrial protein biosynthesis, which is in accordance with published data. In addition to this, a pronounced lack of ribosomal proteins was apparent that hints towards a formerly unknown connection between the modification and their biosynthesis. Preliminary studies for the remaining three modifications i6A, m62A and Ψ presented herein represent a good foundation for subsequent investigations. In conclusion, the data presented in this dissertation analyses the complex interactome of a number of mRNA modifications in an unprecedented depth and quality, among them all four 2’-O-methylated nucleosides. Especially for the adenosine derivative m6A a highly detailed network of readers and repelled proteins in relation to its sequence context could be obtained, which will serve as a valuable resource for future studies. Investigations on the biological role of ms2i6A revealed its interactome and include an in-depth characterization of a knockout cell line lacking this hypermodified mRNA modification.Das zentrale Dogma der Molekularbiologie beschreibt die Weitergabe von genetischer Information über die drei wesentlichen Ebenen DNA, messenger RNA und Protein. Als epigenetische Regulation wird eine vererbbare Modulierung der genetischen Information durch reversible chemische Derivatisierung der Informationsträger, über die Abfolge der kanonischen Basen oder Aminosäuren hinaus, bezeichnet. Diese Form der Regulation ist auf den Stufen der DNA und der Proteine bekannt und teilweise verstanden, chemische Modifikationen der mRNA sind im Vergleich hierzu dagegen nur sehr unvollständig erforscht. Aktuelle Arbeiten zu den RNA-Modifikationen N6-Methyladenosin, N1-Methyladenosin und Pseudouridin deuten darauf hin, dass diese einer aktiven Steuerung unterliegende Modifikationsmuster in mRNA ausbilden. Dies stellt eine bislang nicht bekannte Ebene der Epigenetik, bzw. epigenetischen Regulation dar. Neben Sequenzinformationen stellt die Kenntnis der spezifisch mit solchen Nukleotidderivaten interagierenden Proteine einen unabdingbaren Beitrag zum Verständnis ihrer Funktion dar. In der hier vorgelegten Arbeit wurden Interaktomstudien zu mehreren RNA-Modifikationen durchgeführt, um dieses Verständnis zu vertiefen. N6-Methyladenosin (m6A), N6,N6-Dimethyladenosin (m62A), Pseudouridin (Ψ), N6-Isopentenyl-2-thiomethyladenosin (ms2i6A), N6-Isopentenyladenosin (i6A) und die vier 2’-O-Methylmodifikationen Am, Gm, Cm und Um wurden zu diesem Zweck mittels Festphasensynthese in Oligonukleotide inkorporiert (Abbildung 1). Die hierfür nötigen Phosphoramidite wurden, im Falle von i6A, ms2i6A, m6A und m62A synthetisch dargestellt (15, 22, 29 und 31). In Kooperation mit der Gruppe von Michiel Vermeulen wurden die so erhaltenen RNA-Stränge mit Hilfe von Stable isotope labeling with amino acids in cell cuture (SILAC) in Interaktomstudien eingesetzt. Auf diese Weise konnten sowohl Proteine identifiziert werden, die spezifisch mit den betrachteten Modifikationen interagieren (Reader), als auch solche, die bevorzugt an unmodifizierte Sequenzen binden, also abgestoßen werden. Für das bislang im Zentrum des wissenschaftlichen Interesses stehende m6A konnten so neue Reader identifiziert werden, darunter die RNA-bindenden Proteine FMR1, FXR1 und FXR2, die mit dem Fragilen-X-Syndrom in funktionellem Zusammenhang stehen. Die Erkrankung resultiert aus dem Verlust der RNA-bindenden Funktion des Proteins FMR1 und stellt eine der häufigsten Ursachen für genetisch bedingte geistige Retardierung dar. Eine Steuerung der Interaktion zwischen diesen Proteinen und ihrem RNA-Substrat in Abhängigkeit von dessen Modifikationsgrad stellt einen hochinteressanten, bislang unbekannten Zusammenhang zwischen m6A und der Erkrankung her. Neben diesen Readern konnte zum ersten Mal das negative Interaktom aus abgestoßenen Proteinen charakterisiert werden. Es zeigt ein hohes Maß an Abhängigkeit vom Sequenzkontext der Modifikation und enthält eine Vielzahl von Anhaltspunkten für weitere Untersuchungen. So konnte für das Paar RNA-stabilisierender Proteine G3BP1 und G3BP2 eine selektive Interaktion mit unmodifizierten Oligonukleotiden belegt werden. Hieraus kann ein funktioneller Antagonismus zwischen diesen Proteinen und den bekannten, mRNA-destabilisierenden m6A-Readern der YTH-Familie abgeleitet werden, welcher ebenfalls bislang nicht bekannt ist. Eine kurze grafische Zusammenfassung der Ergebnisse der m6A-Interaktomstudien ist in Abbildung 2 dargestellt. Auch für die Gruppe der ribosemethylierten Nukleoside (Am, Cm, Um, Gm) wurde ein komplexes, weitgehend individuelles Interaktom gefunden. Die Resultate liefern erste Hinweise auf die zellulären Funktionen dieser Gruppe von Modifikationen. Sie deuten darauf hin, dass der sich in aktuellen Studien andeutende Zusammenhang zwischen 2’-O-Methylierung und einer möglichen Interferonantwort auf eine virale Infektion durch Um vermittelt wird. Darüber hinaus zeigen sie, dass mehrere nukleolytisch wirksame Komplexe abgereichert werden und insbesondere Gm die YTHDF-Familie deutlich abstoßt, was einen interessanten Hinweis auf einen moglichen m6A-Gm-Antagonismus darstellt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung der Modifikation ms2i6A, welche eine strukturell ungewöhnlich komplexe Modifikation der mRNA darstellt. Um mehr über die Funktion der Modifikation zu erfahren, wurden Interaktomstudien durchgeführt und eine Knockout-Zelllinie charakterisiert, welche nicht dazu in der Lage ist ms2i6A aus seinem biosynthetischen Vorläufer i6A herzustellen. Die Analysen auf Transkriptom- und Proteomebene (Abbildung 4) zeigten, dass die Abwesenheit des thiomethylierten Adenosinderivates zu einer deutlich messbaren Reduktion der mitochondrialen Proteinsynthese führt, was sich im Einklang mit literaturbekannten Studien befindet. Darüber hinaus zeigte sich aber auch ein schwerer Defekt in der Synthese ribosomaler Proteine, was auf eine bislang nicht bekannt Rolle der Modifikation in diesem Prozess hindeutet. Auch für i6A, m62A und Ψ konnten Gruppen interagierender Proteine identifiziert werden, die Daten bilden eine gute Grundlage für weiterfuhrende Studien. Zusammengenommen bieten die in dieser Dissertation erarbeiteten Daten einen in diesem Umfang und dieser Tiefe bislang nicht verfügbaren Einblick in den komplexen Raum aus Proteinen, die mit Modifikationen der mRNA interagieren. Insbesondere für das Adenosinderivat m6A konnte ein umfassendes Bild seines Interaktoms in Abhangigkeit vom Sequenzkontext und in mehreren Zelltypen erstellt werden. Weiterhin konnte eine detailreiche Phänotypisierung einer ms2i6A-hypomodifizierten Zellinie erreicht werden, die einen bedeutenden Schritt hin zum Verständnis der Rolle dieser mRNA-Hypermodifikation darstellt