Produçao e purificaçao da lipase de Bacillus megaterium CCOC-P2637 e sua aplicaçao em biocatálise em solventes orgânicos

Orientador: David A. MitchellCo-orientadores: Nadia Krieger, José Domingos FontanaTese(doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2004Inclui bibliografiaResumo: Este trabalho teve por objetivo a purificação e a caracterização cinética da lipase selecionada de Bacillus megaterium e a verificação do seu potencial para utilização em biocatálise em meio de solventes orgânicos. Dentre 36 cepas microbianas selecionadas para o screening inicial, a cepa de Bacillus megaterium CCOC P2637 apresentou a mais alta atividade lipolítica, tanto em placas de Petri, como em fermentação líquida (33 U/mL), tendo sido avaliada com relação ao seu potencial para utilização em biocatálise pela caracterização cinética e de estabilidade do extrato bruto e da lipase purificada. Para produção da enzima, o microrganismo foi cultivado em meio contendo sais, extrato de levedura e 1% de óleo de oliva, com incubação a 29 °C e 120 rpm. Após 72 h de cultivo, o sobrenadante foi separado das células por centrifugação e a enzima foi precipitada diretamente do sobrenadante de cultura pela adição de sulfato de amônio (80%), ressuspendida e dialisada, resultando no extrato bruto utilizado nos ensaios seguintes. O extrato bruto apresentou atividade frente a triacilgliceróis com cadeias entre 4 e 18 carbonos e frente a ésteres de p-nitrofenila, destacando-se a maior atividade frente ao palmitato de p-nitrofenila. A temperatura para atividade máxima foi de 55 °C, sendo que a enzima foi razovelmente estável a 60 °C, mantendo 77% do valor inicial após 10 min de incubação. A estabilidade em solventes orgânicos foi estudada por incubação (1h, 30 °C) do extrato bruto em butanol, tolueno, hexano, heptano, isooctano e em várias porcentagens (de 25 a 100%) de acetona, etanol e isopropanol em água. O extrato bruto manteve 100% da atividade inicial nos solventes hidrofóbicos e foi surpreendentemente ativado na presença de porcentagens crescentes de etanol, isopropanol e acetona. A verificação da capacidade de catálise da enzima no sistema de micelas reversas AOT/n-heptano mostrou que as mais altas atividades específicas foram obtidas em W0 ([H2O]/[AOT]) 5 (111 U/mg) e 10 (104 U/mg) e a razão entre a atividade no meio orgânico e aquoso (Ro/a) foi de 1,9, indicando uma maior atividade no meio micelar do que no meio aquoso. Análises preliminares do extrato bruto por cromatografia de gel permeação indicaram que a enzima estava presente na forma de um agregado de alta massa molar. Com o tratamento do extrato bruto com CHAPS 1% (m/v) e aplicação em coluna Phenyl Sepharose Fast Flow obteve-se um fator de purificação de 70 e 18% de recuperação de atividade, observando-se 3 bandas de 32, 50 e 60 kDa na eletroforese SDS-PAGE. Como segunda estratégia de purificação, utilizou-se o tratamento do extrato bruto com isopropanol 30% (v/v), coluna Octyl Sepharose CL4B e eluição com isopropanol 60% (v/v). O fator de purificação obtido foi de 46, com recuperação de 86% da atividade e 3 bandas de 31, 52 e 63 kDa. Apenas a banda de 31 kDa apresentou atividade frente ao MUFbutirato, sendo que sua seqüência amino-terminal demonstrou 93% de homologia com a seqüência interna de uma colesterol esterase de Pseudomonas cepacia. A enzima purificada mostrou-se surpreendentemente mais estável do que o extrato bruto, apresentando atividade máxima em temperatura de 55-65 °C e na faixa de pH entre 6 a 9. A enzima foi estável a 50 °C, mantendo 50% da atividade após 86 min e entre pH 3 e 10,5, por 1h a 29 °C. Estes resultados mostram que a lipase de B. megaterium é uma enzima ainda não descrita na literatura, cujas propriedades cinéticas e de estabilidade são de grande interesse para aplicações em biocatálise.Abstract: This work had as its objective the purification and kinetic characterization of a Bacillus megaterium lipase and the verification of its potencial for use in biocatalysis. The strain Bacillus megaterium CCOC P2637 gave high lipolytic activity both in Petri dishes and shake flask culture (33 U/mL). The initial studies evaluated the potential for use in biocatalysis, the crude extract being used in studies of substrate preference and pH and temperature stability. For these studies, after 72 h of culture the cells were removed by centrifugation and ammonium sulfate was added to the supernatant to 80% of saturation. The precipitate was re-suspended and dialyzed, giving the crude extract. This crude extract hydrolyzed triacylglyerols containing fatty acids of 4 to 18 carbons. It also hydrolyzed fatty-acid esters of p-nitrophenol, with the activity increasing with chain length up to p-nitrophenol palmitate (pNPP). In tests of the effect of temperature on the amount of product formed after 1 min, the optimum temperature was 55 °C. The enzyme was reasonably stable at 60 °C, with 77% residual activity after 10 min of incubation. Stability in organic solvents was studied by incubation (1 h, 30 °C) of the crude extract in neat solutions of the hydrophobic solvents butanol, toluene, hexane, heptane and isooctane and in aqueous solutions (from 25 to 100% (v/v)) of the hydrophilic solvents acetone, ethanol and isopropanol. The crude extract maintained 100% residual activity in the hydrophobic solvents and was actually activated in the presence of increasing concentrations of ethanol, isopropanol and acetone. The catalytic activity against pNPP in AOT/n-heptane reverse micelles was determined, with the highest activities being obtained at W0 ([H2O]/[AOT]) values of 5 (111 U/mg) and 10 (104 U/mg). The ratio of the rates of hydrolysis of pNPP in organic and aqueous systems (RO/A) was 1.9. Preliminary gel permeation chromatography studies showed that the enzyme in the crude extract was in the form of a high molecular weight aggregate. After treatment of the crude extract with CHAPS (1% (m/v)) and application in a Phenyl Sepharose Fast Flow column, the purification factor was 70, with a recovery of activity of 18%. The purified enzyme preparation showed three bands after SDS-PAGE, at 32, 50 and 60 kDa. As a second purification strategy, the crude extract was treated with isopropanol (to 30% (v/v)), applied to an Octyl Sepharose CL4B column and eluted with isopropanol (60% (v/v)). The purification factor was 46 with an 86% recovery. Again three bands were obtained after SDS-PAGE, at 31, 52 and 63 kDa. Only the 31 kDa band showed activity against MUF-butyrate. The amino-terminal sequence of the protein in this band had 93% homology with an internal sequence of a cholesterol esterase of Pseudomonas cepacia. The purified enzyme was more stable than the crude extract, showing maximum activity at 55 to 65 °C and in the pH range from 6 to 9. The enzyme showed a 50% residual activity after 86 min at 50 °C, and was stable during incubation for 1 h at 29 °C at pH values from 3 to 10.5. These results show that the lipase of B. megaterium is an enzyme that has not previously been described in the literature and has kinetic properties and stability characteristics that could suit it to applications in biocatalysis