Produção de surfactina por Bacillus pumilus UFPEDA 448 em fermentação em estado sólido utilizando bagaço de cana e okara como substrato

Orientador : Prof. Dr. David Alexander MitchellCo-orientadora : Prof. Dra. Nadia KriegerTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/07/2012Bbibliografia: fls. 110-120Resumo: Nos últimos anos, os biosurfactantes têm atraído atenção devido a sua baixa toxicidade, alta biodegradabilidade e boa aceitabilidade ecológica. As aplicações destes compostos estendem-se às indústrias petrolífera, alimentícia, farmacêutica, entre outras. Os lipopeptídeos, em especial a surfactina, têm sido muito estudados para aplicações na área da saúde. Entretanto, a utilização destes compostos é limitada devido ao seu alto custo de produção. Este trabalho teve por objetivo desenvolver um processo para a produção de lipopeptídeos por fermentação em estado sólido (FES), gerando dados em escala de laboratório que forneçam a base para futuros estudos de aumento de escala. Inicialmente, foi realizado um screening com a intenção de encontrar uma nova cepa com capacidade para produção de lipopeptídeos. A cepa SALPETRO 2D foi isolada a partir de solo contaminado com petróleo e identificada como Bacillus sp. O sobrenadante de uma cultura submersa utilizando glicerol como fonte de carbono teve a sua tensão superficial reduzida de 41,2 para 27,7 mN.m-1 e apresentou um índice de emulsificação após 24 h (E24) de 55 % para óleo de motor. Em um estudo comparativo entre Bacillus sp. e B. pumillus UFPEDA 448 para a seleção do microrganismo a ser utilizado em FES, a cepa de B. pumilus mostrou-se mais eficiente na produção de biosurfactante, tal como determinado por quantificação indireta por diluição micelar crítica (DMC), técnica que representa o número de diluições necessárias para se alcançar a concentração micelar crítica (CMC). Usando um substrato à base de uma mistura de okara (resíduo sólido da extração do leite de soja) e bagaço de cana (usado como bulking agent), os extratos aquosos das culturas realizadas com B. pumilus e Bacillus sp apresentaram valores de DMC de 32 e 16 respectivamente. O biosurfactante produzido por B. pumilus já era conhecido como sendo um lipopeptídeo composto de uma mistura de homólogos de surfactina, o que facilitou sua quantificação por HPLC. A melhor produção de surfactina por B. pumilus ocorreu em uma mistura 50:50 de okara e bagaço de cana, em massa. Devida a relativamente alta produção de proteases em FES, a pré-hidrólise do okara com protease não aumentou os níveis de surfactina. A temperatura ótima para a produção de surfactina foi de 37 °C, sendo que a temperatura de incubação afeta a razão dos vários homólogos de surfactina produzidos. O cultivo em biorreator de coluna com aeração forçada sob condições otimizadas forneceu um nível de surfactina de 809 mg.L-SU-1 (solução umedecedora), o que corresponde a 3,3 g.kg-SS-1 (sólido seco). Este é o maior nível de surfactina produzida até o momento em FES com um microrganismo não recombinante. A velocidade máxima de captação de O2 de 20 mmol min-1.kg-SS-1 corresponde a velocidade de produção de calor metabólico de 182 W.kg-SS-1. As propriedades tensoativas da surfactina foram semelhantes as relatadas na literatura para a surfactina produzida por fermentação submersa (FS). Estes resultados sugerem que poderia ser viável a utilização de FES para a produção de surfactina, mas atenção especial deve ser dada em larga escala para a remoção de calor.Abstract: Over recent years, biosurfactants have attracted attention due to their low toxicity, high biodegradability and good ecological acceptability. Biosurfactants find applications in the petroleum, food and pharmaceutical industries, amongst others. Lipopeptides, especially surfactin, have been extensively studied for applications in the health industry. However, the use of these compounds is limited due to their high production costs. The objective of the present work was to develop a process for the production of lipopeptides by solid-state fermentation (SSF), generating data at laboratory scale that would provide the basis for future scale-up studies. Initially, a screening was undertaken with the intention of finding a new strain with the capacity to produce lipopeptides. The strain SALPETRO 2D was isolated from soil contaminated with petroleum and was identified as Bacillus sp. The supernatant of a submerged culture using glycerol as a carbon source had its superficial tension reduced from 41.2 to 27.7 mN m-1 and gave a 24-h emulsification index (E24) of 55% for motor oil. In a comparative study between Bacillus sp. and Bacillus pumillus UFPEDA 448 for the selection of a strain to be used in SSF, B. pumillus was a more efficient producer of biosurfactant, as determined by the indirect critical micellar dilution (CMD) technique, which represents the number of two-fold dilutions necessary to reach the critical micellar concentration. Using a substrate based on a mixture of okara (the solid residue that remains after the extraction of soy milk from soybeans) and sugarcane bagasse (used as a bulking agent), aqueous extracts of the cultures undertaken with B. pumilus and Bacillus sp. gave CMD values of 32 and 16, respectively. The biosurfactant produced by B. pumilus was already known to be a mixture of homologues of surfactin, which facilitated its quantification by HPLC. Surfactin production by B. pumilus was best on a 50:50 mixture of okara and sugarcane bagasse, by mass. Due to the relatively high production of proteases in SSF, a proteolytic pretreatment of okara did not increase surfactin levels. The optimum temperature for surfactin production was 37 °C, with the incubation temperature affecting the ratios of the various surfactin homologues. Cultivation in a packed-bed bioreactor with forced aeration under optimized conditions gave a surfactin level of 809 mg L-IS-1 (impregnating solution), which corresponds to 3.3 g kg-DS-1 (dry solids). This is the highest level of surfactin that has been produced to date in SSF with a non-recombinant organism. The maximum O2 uptake rate of 20 mmol min-1 kg-SS-1 corresponds to a rate of production of waste metabolic heat of 182 W kg-SS-1. The tensioactive properties of the surfactin produced in SSF were similar to those reported in the literature for surfactin produced by submerged fermentation. These results suggest that SSF can be used for the production of surfactin, but at large scale special attention will need to be given to heat removal