Transkriptionelle Analyse des Stärkemetabolismus in Solanum tuberosum

This study aimed at identifying regulatory mechanisms underlying starch biosynthesis in potato under various conditions, in different tissues, in transgenic plants with altered central carbon metabolism and in tubers growing at different velocities. For this a new technique was developed to measure tuber growth in vivo. Furthermore, it was aimed to influence starch degradation in terms of its role in sprouting and cold induced sweetening by reducing the expression of specific genes and analysing the results. Comparative transcriptome analysis between leaves and tubers indicate that transient and storage starch biosynthesis might not be all that different with the same isoforms being differentially expressed in both tissues. There was also a diurnal rhythm of GBSS expression in tubers which could be correlated to sucrose supply from the leaves. This provided evidence not only of the diurnal regulation of starch biosynthetic gene expression in tubers, but also showed the importance of sucrose supply in regulating gene expression. Since tuber initiation and growth is not synchronised, it was important to determine the growth velocity of individual tubers. To this end X-ray CT was used to determine the volume of individual tubers at different time points and calculate the growth velocity. This was the first time that the growth velocities of tubers were determined in a natural environment. Tuber growth velocity could not be correlated to starch biosynthetic gene expression, although it was clear that gene expression is different between growing and non-growing tubers. The relationship between gene expression and growth velocity seems to be qualitative rather than quantitative and the data provides important information towards the identification of factors determining potato tuber growth. Further transcriptome based analysis on plants with genetically altered central carbon metabolism reveal that the accumulation of either apoplasmic (U-IN-1) or symplasmic (U-IN-2) hexoses lead to different sugar signals activating different metabolic and physiological processes. U-IN-1 had reduced expression of photosynthesis associated genes which is probably due to the accumulation of glucose in the apoplasmic space, leading to early senescence. In plants expressing sucrose isomerase in either the apoplasmic space (CW-ISO) or vacuole (NTTP), there was an increase in the expression of photosynthetic genes possibly in response to a sugar starvation signal. In both U-IN-1 and U-IN-2 there was a reduction of cell wall biosynthetic gene expression, explained by reduced production of UDP-glucose. Strong evidence for substrate channeling which shifts metabolic flux towards respiration is provided and the involvement of the Srnk1 complex is suggested. Furthermore, a strong negative correlation between GPT and cell wall invertase, possibly mediated by transcription factors, suggest that under “invertase like” conditions plastid transporters are down-regulated, leading to insufficient substrate supply. Reduced supply, resulting in a changed redox state, could explain the indirect effects of reduced fatty acid biosynthetic gene expression and the accumulation of shikimate in U-IN-2. Comparative transcriptome analysis selecting for genes associated with starch biosynthesis was used to identify putative regulators of starch biosynthesis. A bZIP transcription factor from the S-group strongly correlated with starch biosynthesis. Moreover, a uORF associated with this gene was idenfied, as well as five other bZIP transcription factors in the potato genome containing this uORF. The region is known to regulate gene translation in response to the sucrose status. Expression profiles of the other uORF containing bZIP genes support their putative involvement in the regulation of starch and sugar metabolism in potato tubers and warrants further investigation. In plants where all three isoamylases were simultaneously silenced, there were no clear visible effects on the aerial parts of the plants, and no change to tuber yield, but there was a significant reduction in tuber starch content, likely due to the important function of ISA1/ISA2 in amylopectin synthesis. A reduction in the DW/ FW ratio was observed, indicating that there might be less dense packaging of starch, leading to higher water content of granules. There was an increase in small starch granules but no clear structural changes could be observed to either the soluble or insoluble glucans in terms of chain length distribution and it is proposed that due to reduced activity of ISA1/ISA2, but not the complete absence, changes to the glucan and granule structure occurs. This would lead to certain parts of the granule being more soluble and accessible to the degrading enzymes, leading to the production of sufficient amounts of sucrose during storage to initiate early sprouting. Sprouting would also be less coordinated, the reason for an increase in the number of sprouts per tuber. The accumulation of soluble glucans during storage was surprising, and it is believed that it stems from a different source than those produced during starch biosynthesis, which is the accumulation of partly degraded glucans due to reduced ISA3 activity. Through microarray data analysis alpha-amylase 23 was identified to be strongly up-regulated upon sprouting and it was shown that silencing of the gene leads to a delay in sprouting, accompanied by reduced accumulation of glucose in the parenchyma associated with a sprout. Transgenic lines also had reduced cold induced sweetening. This hints towards the direct involvement of the enzyme in starch degradation. Further analyses are required to determine whether the enzyme actively degrades starch, or whether it has a regulatory function. The absence of a predicted plastid transit peptide would indicate that the protein is not targeted to the plastid, but the presence of a signal peptide might mean plastid targeting through alternative mechanisms. The discovery of the gene’s involvement in sprouting and other related processes is not only exciting in terms of unravelling potato starch degradation, but also shows the value of microarray data analysis in identifying important genes.In der vorliegenden Arbeit sollten regulatorische Mechanismen, denen die Stärke-Biosynthese in der Kartoffel unter verschiedenen Bedingungen, in verschiedenen Geweben, in transgenen Pflanzen mit verändertem Kohlenstoff-Metabolismus und in Kartoffelknollen mit unterschiedlichen Wuchsgeschwindigkeiten unterliegt, identifiziert werden. Hierfür wurde eine neue Methode zur Messung des Knollenwachstums in vivo entwickelt. Darüber hinaus wurde beabsichtigt, den Stärke-Abbau durch Reduktion der Expression spezifischer Gene zu beeinflussen und die Ergebnisse in Bezug auf seine Rolle bei der Knollenkeimung und dem „cold-induced sweetening“ zu untersuchen. Vergleichende Transkriptom-Analyse von Blättern und Knollen deutet darauf hin, dass Speicher- und transiente Stärke-Biosynthese möglicherweise nicht so verschieden sind wie bisher angenommen, da die gleichen Isoformen in beiden Geweben differentiell exprimiert sind. Für die Expression von GBSS konnte ein Tagesrhythmus gezeigt werden, der mit der Saccharose-Versorgung über die Blätter korrelierte. Dies erbrachte nicht nur den Nachweis der Tagesverlauf-abhängigen Regulation von Genen der Stärke-Biosynthese in der Knolle, sondern belegte auch die Bedeutung der Saccharose-Versorgung bei der Regulation der Genexpression. Selbst an derselben Pflanze sind Knollen-Inititation und Knollenwachstum nicht synchronisiert, daher war es wichtig, die Wuchsgeschwindigkeit einzelner Knollen zu bestimmen. Aufnahmen mit einem Röntgen-CT wurden verwendet, um das Volumen einzelner Knollen zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen und daraus die Wuchsgeschwindigkeit zu berechnen. Dies erlaubte zum ersten Mal die Bestimmung der Wuchsgeschwindigkeit von Knollen in einer natürlichen Umgebung. Obwohl die Genexpression von wachsenden und nicht-wachsenden Knollen sich eindeutig unterschied, konnte keine Korrelation zwischen Knollenwachstum und Stärke-Biosynthese festgestellt werden. Die Beziehung zwischen Genexpression und Wuchsgeschwindigkeit scheint eher qualitativer als quantitativer Natur zu sein und die hier gezeigten Daten stellen wichtige Information für die weitere Identifikation von Faktoren, die das Knollenwachstum bestimmen, bereit. Weitere Transkriptom-basierte Analyse von Pflanzen mit verändertem zentralen Kohlenstoff-Metabolismus enthüllte, dass die Akkumulation von apoplastischen (U-IN-1) oder symplastischen (U-IN-2) Hexosen zu verschiedenen Zucker-Signalen führt, die wiederum verschiedene metabolische und physiologische Prozesse aktivieren. U-IN-1 zeigte eine reduzierte Expression von Photosynthese-assoziierten Genen, was wahrscheinlich auf die Akkumulation von Glucose im Apoplasten zurückzuführen ist und früh einsetzende Seneszenz verursachte. In Pflanzen, die eine Saccharose Isomerase im Apoplasten (CW-ISO) oder der Vacuole (NTTP) exprimierten, konnte ein Anstieg der Expression von Photosynthese-Genen nachgewiesen werden, möglicherweise als Antwort auf ein Zuckermangel-Signal. Sowohl bei U-IN-1 als auch bei U-IN-2 zeigte sich eine Reduktion der Expression von Genen der Zellwand-Biosynthese, was sich durch die reduzierte Bildung von UDP-Glucose erklären lässt. Zudem gab es starke Belege für ein „Substrat-Channeling“ in U-IN-2, das den Metabolismus in Richtung verstärkter Respiration verschiebt, sowie Hinweise auf die Beteiligung des Snrk1-Komplexes an diesem Prozess. Zusätzlich lässt eine starke negative Korrelation zwischen GPT und Zellwand-Invertase - möglicherweise vermittelt durch Transkriptionsfaktoren - vermuten, dass plastidäre Transportproteine unter „Invertase-ähnlichen“ Bedingungen herunterreguliert werden, so dass es zu unzureichender Substratversorgung kommt. Reduzierte Versorgung und dadurch bedingte Veränderung des Redox-Status könnte auch die indirekten Effekte, reduzierte Expression von Fettsäure-Biosynthese-Genen und Akkumulation von Shikimat in U-IN-2, erklären. Die vergleichende Transkriptom-Analyse wurde darüber hinaus verwendet um Gene, die mit Stärke-Biosynthese assoziiert sind zu selektieren und dadurch mögliche Regulatoren dieses Prozesses zu identifizieren. Ein bZIP Transkriptionsfaktor aus der S-Gruppe korrelierte stark mit Stärke-Biosynthese. Überdies wurde ein uORF identifiziert, der mit diesem Gen assoziiert ist, und es wurden fünf weitere bZIP Transkriptionsfaktoren im Kartoffelgenom ermittelt, die ebenfalls über diesen uORF verfügen. Die uORF Region ist bereits bekannt dafür, die Translation von Genen in Abhängigkeit vom Saccharose-Status zu regulieren. Die Expressionsprofile der ermittelten bZIP Transkriptionsfaktoren mit diesem uORF unterstützen eine mögliche Beteiligung bei der Regulation des Stärke- und Zuckermetabolismus und berechtigen eine eingehendere Untersuchung. Bei Pflanzen, in denen alle drei Isoamylasen gleichzeitig herunterreguliert waren, konnten keine sichtbaren Effekte auf die oberirdischen Teile der Pflanzen und den Knollenertrag festgestellt werden. Statt dessen gab es eine signifikante Absenkung des Stärkegehalts der Knollen, wahrscheinlich bedingt durch die wichtige Rolle von ISA1/ISA bei der Amypektin-Synthese. Eine Reduktion des FW/ DW- Verhältnisses wurde ebenfalls beobachtet, unter Umständen ein Hinweis auf ein weniger dichtes Stärkegeflecht, so dass der Wassergehalt der Stärkekörnchen höher ist. Trotz einer erhöhten Anzahl kleiner Stärkekörnchen konnten weder bei den löslichen noch den unlöslichen Glukanen klare strukturelle Veränderungen bezüglich der Verteilung der Kettenlänge ermittelt werden. Vermutlich führte die durch nicht-vollständige Herunterregulierung noch vorhandene Rest-Aktivität von ISA1/ISA2 zu den Veränderungen der Glukan- und Stärkekorn-Struktur. Durch die strukturellen Modifikationen wären einige Teile eines Stärkekorns löslicher und für abbauende Enzyme leichter zugänglich, so dass wohl die in ausreichenden Mengen gebildete Saccharose das beobachtete verfrühte Auskeimen der Knollen bedingt. Zusätzlich wurde die Koordination der Keimung gestört und es kam zu einer erhöhten Anzahl an Keimen pro Knolle. Bei der Lagerung der transgenen Knollen kam es zu einer überraschenden Akkumulation von löslichen Glukanen, deren Quelle wohl nicht in der Stärke-Biosynthese, sondern in unvollständigem Abbau wegen reduzierter ISA3-Aktivität zu finden ist. Analyse von Microarray-Daten zeigte, dass Alpha-Amylase 23 während der Keimung stark hochreguliert wird. Herabregulierung des Gens führte zu verzögerter Keimung und reduzierter Akkumulation von Glucose im Parenchym direkt unter dem Keim. Das „cold-induced sweetening“ in den transgenen Knollen war ebenfalls vermindert. Beides deutet auf einen direkte Beteiligung des Enzyms am Stärke-Abbau. Weitere Analysen sind nötig um zu klären, ob das Enzym aktiv Stärke abbaut oder eine regulatorische Funktion übernimmt. Das Fehlen eines plastidären Transit-Peptids könnte einerseits bedeuten, dass das Protein nicht im Chloroplasten lokalisiert ist, andererseits könnte das vorhandene Signalpeptid für eine Lokalisierung im Plastiden über alternative Mechanismen sprechen. Die Entdeckung, dass dieses Gen an der Keimung und weiteren zugehörigen Prozessen beteiligt ist, ist nicht nur ein spannender Schritt in der Entschlüsselung des Stärke-Abbaus, sondern zeigt auch die Bedeutung von Microarray-Daten bei der Identifikation wichtiger Gene