Biological control of bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum: Insights into the ecology of antagonists and their complex interaction with the pathogen and the host plant rhizosphere microbiome

Weltweit führen Pflanzenkrankheiten zu starken Beeinträchtigungen der landwirtschaftlichen Produktion, besonders wenn deren Verursacher als Quarantäne-Erreger eingestuft sind. Eine der verheerendsten Krankheiten bei Kartoffel und Tomate, die Schleimkrankheit, wird durch Ralstonia solanacearum (Rs) hervorgerufen, ein epidemisches, bodenbürtiges Quarantäne-Pathogen. Die Persistenz und das jahrelange Überleben von Rs im Boden sowie seine Fähigkeit, eine große Zahl von Wirts- und Nicht-Wirtskulturpflanzen zu besiedeln, ist eine enorme Bedrohung für die Landwirtschaft. Zur Kontrolle des Pathogens sind Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität und zum Suppressionspotential im Boden und in der Rhizosphäre möglicher Wirtspflanzen unerlässlich. In diesem Zusammenhang wurden in dieser Promotionsarbeit die Auswirkungen der Bodenarten (DS, diluvial sand; LL, loess loam; und AL, alluvial loam) und der Kartoffelpflanzensphären (Rhizosphäre, Endorhiza, Endocaulosphäre; Ecto- und Endosphäre der Knolle) auf den Anteil und die Diversität von in vitro-Antagonisten gegen Rs untersucht. Zu diesem Zweck wurden Kartoffelpflanzen unter Feldbedingungen in drei Bodenarten angebaut, die in einer einzigartigen Versuchsfeldanlage seit mehr als 10 Jahren gelagert werden und damit die gleichen Wetterbedingungen und die gleiche Fruchtfolge hatten. Die Untersuchung einer identischen Anzahl dominanter, zufällig gepickter Kolonien aus jeder der Sphären auf in vitro antagonistische Aktivität gegen Rs hat ergeben, dass in allen Sphären Antagonisten unter den dominanten kultivierbaren Bakterien identifiziert werden konnten mit dem höchsten Anteil an Antagonisten in den endophytischen Bereichen. Die molekulare Charakterisierung der Antagonisten ergab, dass mehrere BOX-Genotypen lediglich in einer Bodenart, andere Genotypen hingegen aus zwei bis drei Böden isoliert werden konnten. Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass sowohl die Pflanzensphäre als auch die Bodenart die Diversität und den Anteil von Bakterien mit in vitro antagonistischer Aktivität gegenüber Rs beeinflussen. Eine größere Anzahl von Antagonisten mit für die Pflanze nützlichen Eigenschaften wurde aus Pflanzen isoliert, die in DS-Böden gewachsen waren. Um tiefere Einblicke in die Auswirkungen der drei Bodenarten auf die mit den verschiedenen Pflanzensphären assoziierten Bakteriengemeinschaften zu bekommen, wurden 16S rRNAGenfragmente, die aus der ‚total community‘ DNA (TC-DNA) mittels PCR amplifiziert wurden, mit Hilfe der denaturierenden Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) analysiert. Dadurch konnten die DGGE-Fingerprints der Bakteriengemeinschaften, die mit den fünf Sphären der Kartoffelpflanzen aus den drei Böden assoziiert waren, verglichen werden. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass die - basierend auf der Bodenart - mit den Kartoffelpflanzensphären assoziierten bakteriellen Gemeinschaften sich in der Rhizosphäre und in dem den Knollen anhaftenden Boden deutlich unterschieden, wohingegen die Fingerprints der endophytischen Bakteriengemeinschaften durch deren niedrige Abundanz variabler waren und weniger von der Bodenart beeinflusst wurden. Zusätzlich gab es deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften zwischen den verschiedenen Kartoffelsphären derjenigen Pflanzen, die in der gleichen Bodenart angebaut worden waren, was auf eine nischenspezifische Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften hinweist. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Effekt der Pflanzensphäre deutlich ausgeprägter war als die Auswirkungen des Bodens. Die meisten Antagonisten aus unserer ersten Studie (Kap. 2) gehörten zur Gattung Pseudomonas, die in der Rhizosphäre oft verstärkt auftritt aufgrund ihrer Fähigkeiten, schnell auf Wurzelexsudate zu reagieren, über eine gute Rhizosphärenkompetenz zu verfügen und verschiedene Stoffe mit nützlicher Aktivität für die Pflanze zu produzieren. Wir untersuchten den Einfluss der drei Bodenarten auf die Vielfalt der Pseudomonas-Populationen und Gene mit Bezug auf vorteilhafte Eigenschaften in den verschiedenen Kartoffelpflanzensphären. Die Zusammensetzung der mit diesen Sphären assoziierten Pseudomonas-Gemeinschaften wurde mittels DGGE-Fingerprints von Pseudomonas-spezifischen, aus TC-DNA amplifizierten 16S rRNA-Genfragmenten und mittels Pseudomonas-spezifischer real-time PCR analysiert, um zu bestimmen, inwiefern diese von den Bodenarten und/oder Kartoffelpflanzensphären beeinflusst werden. Die PCR-Southern blot-Hybridisierung wurde ingesetzt, um die Häufigkeit und Verteilung von Pseudomonas-spezifischen Genen (phl, phz, prnD, hcnBC, pcbC, pqqE und gacA) zu erforschen, deren Genprodukte möglicherweise für die biologische Kontrolle und die Förderung des Pflanzenwachstums in verschiedenen Pflanzensphären und Bodenarten bedeutsam sind. Die Diversität der Pseudomonas-Gemeinschaft wurde durch die Bodenart wesentlich beeinflusst. Ein Effekt der Bodenart wurde jedoch nur im nichtdurchwurzelten Boden und in dem Boden, der fest an den Ernteknollen haftete, beobachtet. Sowohl Bodenart als auch Pflanzensphäre bestimmten die Verteilung der funktionellen Gene von Pseudomonas. Mittels Southern blot- Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass die höchste Vielfalt und Abundanz aller getesteten Gene in der Rhizosphäre von in den LL-Böden gewachsenen Kartoffelpflanzen zu finden war (mit Ausnahme von 2,4-Diacetylphloroglucinol [phl]). Unsere Studie hat gezeigt, dass sowohl die Zusammensetzung der Pseudomonas-Populationen als auch die Abundanz und Diversität ihrer funktionellen Gene in der Rhizospäre von der Bodenart beeinflusst wurden und dass Pseudomonas-Populationen, die die untersuchten Gene korreliert mit der Bodenart und der Anreicherung dieser Gene trugen, vom bodenartbedingten Rhizosphären-Effekt abhängig waren. Abschließend wurden drei Gewächshaus-Experimente mit Tomatenpflanzen durchgeführt, um die Rhizosphären-Kompetenz von in vitro-Antagonisten und ihre Fähigkeit der Kontrolle von Rs unter Gewächshausbedingungen zu testen. Die Keimzahl von Rs und der Antagonisten wurde durch selektive Plattierung bestimmt. Zusätzlich wurde die Rs-spezifische Kopienzahl mit Hilfe von real-time PCR und PCR-Southern blot-Hybridisierung des fliC-Gens kultivierungsunabhängig ermittelt. Die mit den potentiellen Antagonisten Bacillus vallismortis (B63) und Pseudomonas brassicacearum (AL2YTEN-142) inokulierten Pflanzen zeigten keine oder eine klare Verzögerung der durch Rs hervorgerufenen Krankheitssymptome, und ihre Rs- Population nahm im Vergleich zu den nicht inokulierten Pflanzen ab. Amplikon-Sequenzierung von 16S rRNA-Genfragmenten, die aus TC-DNA amplifiziert wurden, zeigte deutliche, von der Behandlung abhängige Verschiebungen in den Bakteriengemeinschaften der Tomaten-Rhizosphäre. Von größter Bedeutung ist, dass der starke Rückgang von Rs in Gegenwart der Antagonisten im Gewächshausversuch bestätigt werden konnte und dass dynamische Taxa als Reaktion auf Rs oder die inokulierten Antagonisten bestimmt wurden. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wurden Kolonisierungsmuster von AL2YTEN-142 ermittelt werden. Gfp-positive Zellen wurden in Lateralwurzeln, Wurzelhaaren und Epidermiszellen sowie innerhalb von Xylemgefäßen nachgewiesen. Beide Biokontrollstämme (B63 und AL2YTEN-142) sind somit im Hinblick auf die Kontrolle von Rs unter Feldbedingungen sehr vielversprechend. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Promotionsarbeit einen tieferen Einblick in die Auswirkungen von unterschiedlichen Bodenarten und der Mikro-Umgebung von Pflanzen auf die Gesamt- und Pseudomonas-Gemeinschaften gewährt, wobei der Diversität von Rs-Antagonisten hier besondere Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Eine Auswahl von Antagonisten wurde unter Gewächshausbedingungen an Tomaten bezüglich ihrer Fähigkeit zur biologischen Kontrolle von Rs getestet, und die komplexen Wechselwirkungen zwischen Antagonisten, Pathogen und indigenem Mikrobiom der Rhizosphäre wurden mit Hilfe der Amplikon- Sequenzierung bestimmt. In zukünftigen Untersuchungen soll die Biokontrolle von Rs und die Pflanzenwachstumsförderung an Kartoffeln unter Feldbedingungen in Ägypten getestet werden. Auf Wunsch des Autors / der Autorin ist diese Dissertation nur als Druckausgabe verfügbar.Plant diseases are among the most limiting factors in agricultural production all over the world, particularly when the causal agent is characterized as quarantine pathogen. One of the most devastating diseases is bacterial wilt of potato and tomato caused by Ralstonia solanacearum (Rs) which is regarded as an epidemic soil-borne quarantine pathogen. The persistence and survival of Rs in soil for years and its ability to colonize a huge number of hosts and non-host crops poses a huge agricultural threat. In order to cope with such pathogen, investigations into the microbial diversity and suppressive potential in the soil and hizosphere of potential host plants are fundamental. In this context, we elucidated the effect of the soil types (DS, LL and AL) and the potato plant sphere (rhizosphere, endorhiza, endocaulosphere; tuber ecto- and endosphere) on the proportion and diversity of in vitro antagonists towards Rs. For this purpose, potato plants were grown under field conditions in three soil types that were stored at a unique experimental field site for more than ten years under the same weather conditions and cropping history. Screening equal numbers of dominant randomly picked colonies from each sphere for in vitro antagonistic activity towards Rs showed that in all spheres antagonists were detected among the dominant cultivable bacteria and that the highest proportion of antagonists was observed in the endophytic compartments. While several genotypes were detected only in one soil, other genotypes were isolated from two or three soils and in some cases with a preference to a particular soil. Based on these results, it is possible to conclude that both, plant sphere and soil types, affect the diversity and proportion of bacteria with in vitro antagonistic activity towards Rs. More antagonists with beneficial characteristics were isolated from plants grown in DS soils. However, to get more insights into the effect of the three soil types on the bacterial community associated with different plant spheres, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of 16S rRNA gene fragments amplified from total community DNA (TC-DNA) was employed to compare the bacterial communities associated with the five spheres of potato plants grown in the three soil types. Our results showed that, based on the soil types, bacterial communities associated with potato plant spheres differed significantly only in the rhizosphere and in the soil attached to tuber while the endophytic bacterial communities were more variable and less influenced by the soil type. Additionally, bacterial community composition significantly differed between different potato spheres of the plants that were grown in the same soil type indicating niche-specific bacterial communities. Furthermore, our results indicated that the effect of the plant sphere was more pronounced than that of the soil type. Most of the antagonists obtained in our first study (Chapter 2) were affiliated with the genus Pseudomonas which is often enriched in the rhizosphere due to their good rhizosphere competence as well as their ability to rapidly respond to root exudates and to produce multiple compounds with plant beneficial activity. We explored the influence of the three soil types on the abundance of Pseudomonas populations and genes related to beneficial traits in different potato plant spheres. Pseudomonas community composition associated with potato plant spheres was analyzed by DGGE of Pseudomonas-specific 16S rRNA gene fragments amplified from TC-DNA and Pseudomonas-specific real-time PCR as influenced by the soil types and/or potato plant spheres. PCR-Southern blot hybridization was used to investigate the prevalence and distribution of Pseudomonas-specific genes encoding biological control and plant growth promoting related functions (phl, phz, prnD, hcnBC, pcbC, pqqE and gacA) in different plant spheres and soil types. The Pseudomonas community composition and abundance was significantly influenced by the soil type. The effect of soil types was only pronounced in the bulk soil and the soil tightly attached to the yield tubers. Both soil type and plant sphere had a very distinct effect on the distribution of Pseudomonas functional genes. Southern blot hybridization indicated the highest abundance of all tested genes was detected in the rhizosphere of potato plants grown in the LL soils, except for the 2,4-diacetyl phloroglucinol (phl). Our study indicated that Pseudomonas populations carrying the tested genes correlated with the type of soil and the enrichment of these genes, depended on the soil type-dependent rhizosphere effect. Finally, three greenhouse experiments with tomato plants were performed to evaluate the rhizocompetence of in vitro antagonists and their ability to control Rs. The population densities of Rs and antagonists were estimated by selective plating and in TC-DNA by means of real-time PCR and fliC gene PCR-Southern blot hybridization. Bacillus vallismortis (B63) and Pseudomonas brassicacearum (AL2YTEN-142)-inoculated plants showed a pronounced delay or no disease symptoms and significantly decreased in Rs population compared to the uninoculated plants. Amplicon sequencing of 16S rRNA gene fragments amplified from TC-DNA revealed pronounced treatment-dependent shifts in bacterial communities of the tomato rhizosphere. Most important, the strong reduction of Rs in the presence of the antagonists was confirmed and dynamic taxa in response to Rs or the inoculants were identified. Confocal laser scanning microscopy uncovered colonization patterns of the AL2YTEN-142. Gfp-positive cells were detected in lateral roots, root hairs and epidermal cells and within xylem vessels. Both inoculants hold great promise to control Rs under field conditions. In conclusion, this thesis provides deeper insights into the influence of different soil types and plant microenvironments on total bacterial and Pseudomonas communities regarding their composition and functional diversity, paying particular attention to the diversity and abundance of antagonists of Ralstonia solanacearum. A selection of antagonists was tested for in planta biological control of Rs, and the complex interactions between antagonists, pathogen and indigenous rhizosphere microbiome were investigated. In future studies, the biological control of Rs and the plant growth promotion will be tested on potatoes under field conditions in Egypt. Upon author request this thesis is available as printed version only