Pro- und Anti-inflammatorische Aspekte in der Pathogenese der Offenwinkelglaukome

In this study, morphological alterations were investigated that prevailed in the trabecular meshwork (TM) of steroid-treated bovine eyes and in trabeculectomy specimens derived from uveitic glaucoma patients. Porcine anterior eye perfusion was performed to examine the effect of pro- and anti-inflammatory cytokines on the intraocular pressure (IOP) and on the expression of the endothelial leukocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1) in the TM. 4 steroid-treated bovine eyes were examined histologically and electronmicroscopically as to the morphological alterations occurring within the TM. The steroid-induced changes comprised vast accumulations of extracellular material (plaques) directly underneath the inner endothelial lining of the vessel loops, comparable to the ones observed in human Primary open angle glaucoma (POAG) specimens. Multiple layers of basement-membrane-material were found within the TM beams, resembling the structures also displayed by human steroid glaucoma specimens. Like in steroid glaucoma, these layers separated the central cores of the TM beams from the overlying TM cells. Conspicuous fingerprint-like formations of basement-membrane-material were found between the TM beams and within the subendothelial region. 6 trabeculectomy specimens derived from uveitic glaucoma patients were subjected to histological and ultrastructural examination. The glaucomatous disorder had been due to different underlying inflammatory diseases: 4 cases of Fuchs’ Heterochromic Cyclitis (FHC), 1 case of Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA) and 1 case of ocular Herpes zoster infection. All cases exhibited plaques and fine-fibrillar material underneath the inner wall endothelium of Schlemm’s Canal. They displayed a marked thickening of many TM beams. In the FHC specimens, these thickenings were due to large amounts of fine fibrils, deposited between the basement membranes of the beams and the surrounding TM cells. In the JIA specimen, the basement membranes themselves were thickened due to inclusions of long spacing collagen. The Herpes zoster specimen showed fingerprint-like patterns of augmented basement-membrane-material enveloping the central cores of the TM beams, as well as accumulations of fine-fibrillar material. In this study we scrutinised whether the inflammatory cytokines IL-1alpha, IL-1beta and IL-6 can simultaneously lower the IOP and induce ELAM-1 expression in the TM. For this, 30 pairs of porcine anterior eye segments were subjected to perfusion culture, with the respective right eyes being exposed to 48h cytokine treatment and the left ones serving as untreated controls. 12 eyes received IL-1alpha, 12 were perfused with IL-1beta, and 6 with IL-6 (30 ng/ml each). The IOP was monitored throughout every experiment. TM tissue samples were harvested directly after perfusion and subjected to semiquantitative polymerase chain reaction (PCR). TM samples derived from IL-1alpha and IL-1beta perfusion were also subjected to western blot analysis. IL-1alpha and IL-1beta were able to lower the IOP while inducing ELAM-1 expression in the TM. IL-6 administration neither altered the IOP situation, nor was it capable of eliciting ELAM-1 induction. 12 anterior eye segments received IL-1alpha treatment (30 ng/ml) for 24h, followed by a 24h-period of double treatment with IL-1alpha (30 ng/ml) and transforming growth factor-beta2 (TGF-beta2, 10 ng/ml). As TGF-beta2 had been shown to significantly elevate the IOP and to be of increased concentration in the aqueous humour of many POAG patients, it was administered to investigate, if it is able to counteract the IL-1alpha-induced IOP decline, and if it influences ELAM-1 expression. The results show that TGF-beta2 increases the previously lowered IOP, and counteracts the IL-1alpha-associated pressure-effect. ELAM-1 expression was sustained, but downregulated after IL-1alpha/TGF-beta2 double treatment. This dissertation shows topical long-term steroid treatment of bovine eyes to increase IOP, which is associated with morphological alterations of the trabecular outflow pathway. These are comparable to the changes observed in human POAG eyes. With the bovine system we are providing the first animal model in which to study the pathogenesis of glaucomatous IOP elevations. The results further indicate that the heterogenic field of uveitic glaucoma is characterised by the deposition of excess ECM in the TM in the form of subendothelial plaques, fine-fibrillar material and basement-membrane-material. This study provides critical evidence, that the trabecular outflow of aqueous humour is impaired by extracellular material probably augmented by antiinflammatory factors. By application of the porcine anterior eye perfusion, it was possible to prove IL-1, but not IL-6, to significantly lower the IOP while concomitantly inducing ELAM-1 in the TM. Moreover, TGF-beta2 was shown to counteract the IL-1-mediated pressure-effects, but not to extinguish ELAM-1 expression.Pro- und anti-inflammatorische Mechanismen spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Pathogenese zahlreicher Glaukome. Für Krankheiten wie dem Steroidinduzierten (Steroidglaukom) oder dem Uveitisassoziierten Sekundärglaukom (Uveitisglaukom) ist diese Rolle offensichtlich. Den bislang daraufhin untersuchten Untergruppen des Grünen Stars ist darüber hinaus gemein, dass sie das Adhäsionsmolekül „endothelial leukocyte adhesion molecule-1“ (ELAM-1) glaukomspezifisch an der Oberfläche von Trabekelwerkszellen exprimieren. ELAM-1 stellt einen der ersten endothelialen Marker in der Entzündungskaskade dar und ist durch proinflammatorische Zytokine wie Interleukin-1 (IL-1) induzierbar. Folglich liegt nahe, dass inflammatorische Gesichtspunkte für das Verständnis aller momentan anerkannten Unterarten des Glaukoms entscheidend sein könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden morphologische Veränderungen des Trabekelwerkes in steroidbehandelten Rinderaugen sowie in Trabekelektomiestückchen, die von Uveitisglaukompatienten stammten, untersucht. Darüber hinaus wurden vordere Schweineaugenabschnitte mit pro- und antiinflammatorischen Zytokinen perfundiert, um herauszufinden, welchen Effekt diese Zytokine auf den Augeninnendruck und die Expression von ELAM-1 im Trabekelwerk haben. Vier steroidbehandelte Rinderaugen wurden licht- und elektronenmikroskopisch auf morphologische Veränderungen im Trabekelwerk hin untersucht und mit den unbehandelten kontralateralen Augen verglichen. Die Augen zweier gänzlich unbehandelter adulter Rinder sowie sieben Kälberaugen dienten als zusätzliche Kontrollen. Die steroidinduzierten Veränderungen des bovinen Trabekelwerks umfassten unter anderem deutliche Ansammlungen extrazellulären Materials (Plaques) direkt unterhalb des Innenwandendothels der Gefäßschlingen (bovines Äquivalent zum Schlemm-Kanal), die den beim Primären Offenwinkelglaukom (POWG) des Menschen auftretenden Plaques vergleichbar waren. Außerdem wurde, ähnlich wie beim Steroidglaukom des Menschen, eine Anhäufung mehrerer Schichten von Basalmembranmaterial auf den Trabekeln nachgewiesen, die den bindegewebigen Trabekelkern von den aufliegenden Trabekelzellen separierten. Auffällige Formationen fingerabdruckartigen Basalmembranmaterials wurden zusätzlich zwischen den Trabekeln und in der subendothelialen Region gezeigt. Zusammenfassung 6 Genauere Untersuchungen der subendothelialen Plaques enthüllten Typ-VI-Kollagen enthaltendes feinfibrilläres Material als Hauptbestandteil. Sechs von Uveitisglaukompatienten stammende Trabekelektomiestücke wurden sorgfältiger licht- und elektronenoptischer Analysen unterzogen. Den glaukomatösen Schädigungen lagen unterschiedliche entzündliche Ausgangserkrankungen zugrunde. Sie umfassten vier Fälle von Fuchs’scher Heterochromiecyklitis (FHC), einen Fall von Juveniler Idiopathischer Arthritis (JIA) und einen weiteren Fall von okulärer Herpes zoster Infektion. Neben einigen Stellen, die ganz offensichtlich lytischer Aktivität unterworfen waren, wiesen alle sechs Fälle deutliche Plaques und feinfibrilläres Material unter dem Innenwandendothel des Schlemm-Kanals auf. Außerdem zeigten sie ausgeprägte Trabekelverdickungen in einem großen prozentualen Anteil des Trabekelwerks. In den FHC-Exemplaren bestanden diese Verdickungen aus großen Ansammlungen von Typ-VI-Kollagen enthaltendem feinfibrillären Material, das zwischen die trabekuläre Basalmembran und die aufliegenden Trabekelwerkszellen abgelagert war. Im JIA-Exemplar waren die trabekulären Basalmembranen aufgrund von deutlich ausgeprägten Gitterkollageneinschlüssen stark verdickt. Im Herpes-zoster-Fall wurden die trabekulären Bindegewebskerne von fingerabdruckartig abgelagertem Basalmembranmaterial sowie von feinfibrillärem Material umgeben. In allen quantitativ untersuchen Trabekelektomiestücken war der Anteil an extrazellulärem Material im Trabekelwerk signifikant erhöht. Eine weitere Aufgabenstellung dieser Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die inflammatorischen Zytokine IL-1α, IL-1β und IL-6 über das Potential verfügen, den intraokulären Druck (IOD) zu senken und gleichzeitig die Expression von ELAM-1 im Trabekelwerk zu induzieren. Um dies zu untersuchen, wurden 30 Schweineaugenpaare der Vorderkammerperfusion unterzogen, wobei jeweils die rechten Augen für 48 Stunden mit den entsprechenden Zytokinen behandelt wurden, und die linken Augen als kontralaterale Kontrolle dienten. Zwölf Augen wurden mit IL-1α behandelt, zwölf weitere mit IL-1β und sechs Augen wurden mit IL-6 perfundiert (jeweils 30 ng/ml). Die Entwicklung des Augeninnendruckes wurde während der vollen Länge jedes Experimentes aufgezeichnet. Das Trabekelwerk wurde nach Perfusionsende entnommen und mRNA- sowie Proteinregulation bezüglich ELAM-1 über semiquantitative und quantitative Polymerasekettenreaktion sowie Western blot evaluiert. Jedem perfundierten Vorderaugenabschnitt wurden außerdem je zwei Zusammenfassung 7 korneosklerale, das Trabekelwerk enthaltende, Gewebsstücke entnommen und der morphologischen Analyse sowie der Überprüfung der strukturellen Unversehrtheit zugeführt. IL-1α und IL-1β konnten den Augeninnendruck bei gleichzeitiger trabekulärer Induktion von ELAM-1 signifikant senken; beide Effekte waren durch IL-6-Gabe nicht zu erzielen. Keiner der durchgeführten Perfusionsversuche führte zu nachweisbaren morphologischen Veränderungen im Trabekelwerk. Weitere zwölf Vorderaugenabschnitte wurden für 24 Stunden mit IL-1α (30 ng/ml)behandelt und erfuhren daraufhin eine 24-stündige Doppelbehandlung mit IL-1α (30 ng/ml) und „transforming growth factor-β2“ (TGF-β2, 10 ng/ml). Da TGF-β2 im porcinen und humanen System nachweislich den Augeninnendruck steigert, und bei einem großen Prozentsatz der Primären Offenwinkelglaukomfälle in erhöhter Konzentration im Kammerwasser vorliegt, wurde dieses Zytokin hier appliziert um herauszufinden, ob es in der Lage ist, den IL-1α-induzierten Augeninnendrucksabfall gegenzuregeln, und ob es die ELAM-1 Expression im Trabekelwerk beeinflusst. Die Ergebnisse zeigen, dass TGF-β2 den vorab durch IL-1α gesenkten Augeninnendruck wieder signifikant ansteigen lässt und daher durchaus in der Lage ist, den IL-1α- abhängigen Druckeffekten gegenzusteuern. Die ELAM-1-Expression wurde zwar aufrechterhalten, aber durch die IL-1α/TGF-β2-Doppelbehandlung doch deutlich herunterreguliert, wie sich durch quantitative PCR und Western blot an nach der Doppelperfusion geernteten Trabekelwerk-Gewebeproben zeigte. Zusätzliche Experimente, bei denen die beschriebene Doppelbehandlung auf ein porcines Trabekelzellkultursystem übertragen wurde, ergaben vergleichbare Ergebnisse nach semiquantitativer Polymerasekettenreaktion. Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen, dass eine okuläre Langzeitbehandlung von Rindern mit Steroiden eine Erhöhung des IOD hervorruft, der mit morphologischen Veränderungen im trabekulären Abflussbereich assoziiert ist. Diese Veränderungen sind den beim POWG des Menschen anzutreffenden subendothelialen Plaques vergleichbar. Dies ist somit das erste Tiermodell, an dem die Pathogenese der glaukomatösen IOD-Erhöhung untersucht werden kann. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass das Gebiet der Uveitisassoziierten Sekundärglaukome zwar als sehr heterogen anzusehen ist. Doch wird es neben einigen untergeordneten Stellen lytischer Aktivität vor allem von der zusätzlichen trabekulären Ablagerung extrazellulären Materials in Form subendothelialer Plaques, Zusammenfassung 8 feinfibrillären Materials und/oder überschüssigen Basalmembranmaterials dominiert. Damit zeigt diese Studie, dass nicht – wie bisher diskutiert – Entzündungszellen oder durch Entzündung entstandene Zelltrümmer oder Eiweißkoagulate die Kammerwasser-Abflusswege verlegen, sondern, dass wahrscheinlich antiinflammatorische Faktoren die vermehrte Bildung von extrazellulärem Material im Trabekelwerk induzieren. Durch die Anwendung des porcinen Vorderaugen-Perfusionssystems war es erstmalig möglich, darzustellen, dass IL-1, nicht aber IL-6, den Augeninnendruck signifikant senkt und gleichzeitig die Expression von ELAM-1 im Trabekelwerk induziert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass TGF-β2 in der Lage ist, IL-1-vermittelte Druckeffekte gegenzuregeln, nicht jedoch, die ELAM-1 Expression im Trabekelwerk aufzuheben. Bei etwa 50 Prozent aller POWG-Patienten ist der Kammerwassergehalt an TGF-β2 erhöht. Bei allen bislang daraufhin untersuchten POWG-Patienten wird – im Gegensatz zu nicht an Glaukom leidenden Menschen – ausserdem ELAM-1 im Trabekelwerk exprimiert. Da ELAM-1 durch den potenten IOD-Senker IL-1 induziert wird, könnte es durchaus sein, dass – ähnlich wie wir es bereits für das Uveitisglaukom zeigen konnten – nach leichten chronischen Entzündungen im Auge bei einigen Patienten antiinflammatorische Faktoren gebildet werden, die eine überschießende bindegewebige Reaktion und schließlich ein Glaukom hervorrufen