Structural biology of the transcription regulators YvoA and the reverse tetracycline repressor variant L17G

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung des allosterischen Mechanismus zweier bakterieller Transkriptionsregulatoren, und zwar von YvoA aus Bacillus subtilis und dem reversen Tetracyclin-Repressor L17G aus Escherichia coli (revTetR1). YvoA ist ein Transkriptionsregulator aus der GntR/HutC Familie, der mutmaßlich die Genexpression N-Acetylglucosamin-abbauender Enzyme in B. subtilis kontrolliert. Die Kristallstruktur von freiem YvoA in voller Länge wurde mittels multi-Wellenlängen anomaler Dispersion bei 2.40 Å Auflösung gelöst. Die Struktur zeigt einen dimeren Aufbau aus zwei Domänen, nämlich einer DNA- und einer Effektor-Bindestelle in der N-terminalen bzw. der C-terminalen Domäne. Die C-terminale Domäne weist eine Chorismat-Lyase-Faltung mit einem antiparallelen β-Faltblatt im Kern auf, das das Dimer-Interface bildet. Zielgerichtete Mutagenese in Verbindung mit kalorimetrischen Messungen zeigten eine N Acetylglucosamin-6-Phosphat-Bindestelle auf dem zentralen antiparallelen β-Faltblatt auf. Die N-terminale Domäne enthält ein winged Helix-Turn-Helix DNA-Bindemotiv in einer vermutlich induzierten Orientierung. Die DNA-bindende Konformation wurde aus Homologie-Modellierung und Disulfid-verbrückten Mutanten hergeleitet. Analytische Gelfiltrations-Chromatographie und kalorimetrische Messungen ermöglichten schließlich ein "Hampelmann"-Modell für die allosterische Induktion von YvoA abzuleiten, das zum ersten Mal einen Einblick in den Induktionsmechanismus eines Mitglieds der GntR/HutC erlaubt. Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung der strukturellen Grundlagen der Aktivitätsumkehr bei TetR. Während Wildtyp TetR an seine tet-Operatorsequenz in Abwesenheit von Tetracyclin bindet und von DNA bei Induktorbindung freigesetzt wird, bindet revTetR nur in Anwesenheit des Korepressors Anhydrotetracyclin (ATC) an DNA. Dennoch unterscheidet sich revTetR L17G von TetR einzig durch eine Mutation im Interdomänen-Interface zwischen der DNA-Bindedomäne und dem Proteinkern. Das Protein wurde bezüglich der Effekte von Korepressor- und DNA-Bindung mittels Limitierter-Proteolyse-Assays und CD-Spektroskopie analysiert. Außerdem wurde die Kristallstruktur von revTetR L17G im Komplex mit ATC bei 1.74 Å Auflösung gelöst. Die Struktur und biochemische und biophysikalische Daten zeigten erstens, dass Effektor-freies homodimeres revTetR von vornherein nicht an DNA binden kann, weil die DNA-Bindeköpfe partiell ungefaltet sind, zweitens, dass als Voraussetzung zur DNA-Bindung die Bindung des Korepressors einen Übergang von ungeordnet zu geordnet induziert, und drittens, dass ein geschwächtes Interdomänen-Interface revTetR-[Mg-ATC]+ eine Justierung und Bindung an seine Operatorsequenz erlaubt. Diese Ergebnisse legen einen Mechanismus offen, der sich vom Induktionsmechanismus des Wildtyp TetRs vollständig unterscheidet.The aim of this work was to elucidate the allosteric mechanism of two different bacterial transcription regulators, namely YvoA from Bacillus subtilis and the reverse tetracycline repressor variant L17G from Escherichia coli (revTetR1). YvoA is a bacterial GntR/HutC transcription regulator that is implicated in the control of gene expression of N-acetylglucosamine degrading enzymes in B. subtilis. The crystal structure of full-length YvoA in the free state was determined by multi-wavelength anomalous dispersion at 2.40 Å resolution. The structure reveals a homodimeric assembly comprising a two-domain fold, with DNA-binding and effector-binding sites located in an N-terminal and C-terminal domain, respectively. The C-terminal domain contains a chorismate lyase fold, containing an antiparallel β-sheet in the core forming the dimer interface. Site-directed mutagenesis together with calorimetric measurements revealed an N acetylglucosamine-6-phosphate-binding site, located on top of the central antiparallel β sheet. The N-terminal domain contains a ‘winged helix-turn-helix’ DNA-binding motif arranged in a probably induced orientation. The YvoA DNA-binding conformation was deduced by homology modelling and disulfide-bridged mutants. Analytical gel filtration chromatography and calorimetric measurements allowed delineating the mode of YvoA-DNA interaction. From these data it was possible to deduce a ‘jumping jack’ model for the allosteric induction of YvoA, providing for the first time insight into the induction mechanism of a GntR/HutC family member. The second part deals with the investigation of the structural basis of activity reversal of TetR. While wild-type TetR binds to the tet operator sequence in the absence of tetracycline and is released from DNA upon inducer binding, revTetR only binds to DNA in the presence of its corepressor anhydrotetracycline (ATC). Despite, RevTetR L17G differs from TetR solely by one mutation in the interdomain interface between the DNA-binding domain and the protein core. The protein has been analysed regarding the effects of corepressor and DNA binding by employing limited proteolysis assays and CD spectroscopy. In addition, the crystal structure of revTetR L17G in complex with ATC has been determined at 1.74 Å resolution. The structure in combination with biochemical and biophysical data shows (i) that effector-free homodimeric revTetR cannot bind to DNA a priori because the DNA-binding heads are partially unfolded, (ii) that binding of the corepressor elicits a disorder-to-order transition of the DNA-binding domains as a prerequisite to DNA binding, and (iii) that a weakened interdomain interface allows revTetR-[Mg-ATC]+ to adjust and bind to its operator sequence. The results of this study reveal that this mechanism is completely different from the mechanism that causes induction of TetR in the wild-type protein