Characterization of the regulatory mechanism of Bacillus subtilis Fnr

Der Redoxregulator Fnr aus Bacillus subtilis ist Teil der Regulationskaskade, die eine Anpassung des Bakteriums an anaerobe Bedingungen erlaubt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch in vitro Transkription und in vivo Komplementation gezeigt, dass ein Eisen-Schwefel-Zentrum pro Fnr-Molekül für die Aktivität des Regulators essentiell ist. Mutationsanalysen identifizierten drei Cysteinreste als Liganden des [4Fe- 4S]2+-Zentrums. Weiterhin wurde eine Sauerstoff-unabhängige, dimere Form des Regulators beobachtet. Das Fnr-Regulon wurde durch Untersuchung des Transkriptoms in Kombination mit der bioinformatischen Suche nach potentiellen Fnr-Boxen im B. subtilis Genom definiert. Drei Gengruppen wurden identifziert. Gene der Gruppe 1 (narKfnr, narGHJI, arfM) werden anaerob von Fnr induziert. Die zugehörigen Promotoren weisen eine funktionelle Fnr-Box auf, die eine direkte Wechselwirkung des Regulators vermuten lässt. Gengruppe 2 (alsSD, ldhlctP, ywcJ, cydABCD) wird in erster Linie in Anwesenheit von Nitrat reprimiert. Durch Mutagenese konnte eine Fnr-Wechselwirkung und folglich eine direkte Abhängigkeit der entprechenden potentiellen Fnr-Boxen ausgeschlossen werden. Vielmehr wurde gezeigt, dass die Expression der Gengruppe 2 durch die Bildung der Nitratreduktase induziert wird. Eine transkriptionelle Aktivierung der Gengruppe 3 (z.B. ykuNOP, ydbN) ist abhängig von der Fnr induzierten Nitratreduktase-Aktivität und der damit verbundenen Umsetzung von Nitrat zum regulatorisch aktiven Nitrit. Unabhängig davon wurde eine Nitrat-abhängige Induktion des acoABCL Operons beobachtet, dessen Promotor keine Fnr-Box aufweist. Ein regulatorisches Modell für die Fnr-abhängige Genexpression wurde erstellt. Diese Ergebnisse lassen eine unterschiedliche Evolution von B.subtilis Fnr und Escherichia coli Fnr vermuten.The Bacillus subtilis redox regulator Fnr is an integral part of the regulatory cascade required for the adaptation of the bacterium to low oxygen tension. In this work, in vitro transcription and in vivo complementation proved the essential role of an intact iron-sulfur-cluster for Fnr activity. Furthermore, mutational analysis in vivo and biochemical characterization in vitro demonstrated that one [4Fe- 4S]2+-cluster per Fnr molecule is coordinated by three cysteine residues (C227, C230, C235). A stable and oxygen-independent dimeric structure of Fnr was observed. The Fnr regulon was defined via transcriptomics in combination with a bioinformatic based binding site prediction. Three distinct groups of Fnr-dependent genes were found. Group 1 genes (narKfnr, narGHJI, arfM) are anaerobically induced by Fnr. All corresponding promoters contain an essential Fnr-binding site suggesting their induction by direct Fnr interaction. Group 2 genes (alsSD, ldhlctP, ywcJ, cydABCD) are characterized by an anaerobic repression in the presence of nitrate. Mutational analysis of the Fnr-binding sites found in three of the corresponding promoters excluded their function in Fnr-mediated repression. Genetic evidence was accumulated that group 2 genes are anaerobically repressed by nitrate reductase formation. Group 3 genes are characterized by their Fnr-dependent activation in the presence of nitrate and the lack of an Fnr-binding site in their promoters. The analysis of Group 3 gene transcription (ykuNOP, ydbN) indicated that Fnr induces nitrate reductase production which leads to the formation of the regulatory compound nitrite from nitrate. The acoABCL operon, lacking an Fnr-binding site, requires Fnr-dependent nitrate reductase formation for its anaerobic induction. A regulatory model for the observed Fnr-mediated gene expression was deduced. Finally, these results suppose a largely independent evolutionary route of B. subtilis and Escherichia coli Fnr