Μελέτη θερμοεπαγωγής και βιολογικών ρολογιών στο έντομο Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae)

Diapause is a period of endocrine-mediated metabolic and developmental arrest induced by changes in abiotic cues that indicate the onset of adverse environmental conditions, such as winter. All eukaryotes, and some prokaryotes, have evolved a circadian clock that is set by light to time various daily activities at the biochemical, physiological and behavioural levels. Some of these organisms have evolved photoperiodism, a response to the length of day or night for the timing of development, reproduction and diapause in anticipation of seasonal changes in the environment. Circadian clocks are molecular time-keeping mechanisms that reside in a diverse range of cell types in a variety of organisms. Since both circadian rhythms and photoperiodism rely upon daily cycles of environmental change, it seems reasonable to assume that the same clock elements are involved in both processes. However, the functional molecular elements involved in the photoperiodic response are still veiled. The challenge of the proposed work is to define the cross talk between internal signalling pathways and external cues in a combinatorial way leading into insect diapause. D. melanogaster is an excellent genetic model but not well understood in terms of ecology, as diapause, while Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) has a number of advantages, such as larval facultative diapause. The Mediterranean corn borer is an oligophagous insect on a narrow range of Gramminae and it is considered a major insect pest of maise Zea mays L. (Poaceae) in several countries of the Mediterranean basin. It over winters as full grown diapausing larva and adults emerge from late March to May. Larval diapause is induced by short-day photoperiods.The objectives of the present work are: A. The biological clocks of S. nonagrioides. B. The Heat Shock Proteins of S. nonagrioides.A. The biological clocks of S. nonagrioides1. One of our long-range goals is to probe the roles of the various clock genes in the photoperiodic determination of larval diapause in the corn stalk borer Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae). As a first step toward this goal, we report here the sequences and expression patterns of period (per), timeless (tim), cycle (cyc) and cryptochrome (cry) mRNA in S. nonagrioides. Our results, which focus on the larval head, demonstrate the influence of daylenght on the expression of these genes. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the genes show similarity to homologous genes in other insects that have been investigated. The PERIOD protein has in PAS domain the pentapeptide GTPEK-like sequence. A diel rhythmicity of per and tim abundance was detected in the larvae heads (peak during scotophase). Also, diel rhythmicity of cry and cyc mRNA abundance was detected in the larvae heads (peak during scotophase). The abundance of cyc mRNA was quite low compared to per, tim and cry mRNA. Photoperiod influenced the expression patterns of per, tim, cry and cyc mRNA abundance mRNA: the peak of per mRNAs expression shifted in concert with onset of the scotophase, while the shift in tim mRNA expression was less pronounced. The amplitude of tim mRNA was severely dampened under long day length, but that of per mRNA was not affected. These distinct patterns of expression suggest that this information could be used to determine photoperiodic response such as diapause 2. Photoperiodic clocks allow organisms to predict the coming season. In insects, the seasonal adaptive response mainly takes the form of diapause. The extensively studied photoperiodic clock in insects was primarily characterized by a “black-box” approach, resulting in numerous cybernetic models. This is in contrast with the circadian clock, which has been dissected pragmatically at the molecular level, particularly in Drosophila. In the current study, we explored different ways in which identified molecular components of the circadian pacemaker may play a role in photoperiodism. In order to evaluate the potential effects of clock gene on diapause regulation, we designed several experimental schedules. Here we examined by Real Time PCR the expression of snoper, snocry snotim and snocyc mRNAs in the head of larval, reared under condition: 1st cycle, L10: 14D. 2nd cycle: LD10:62 (3 days cycle) and 3rd cycle: L10:14D: 10L: 62D (4 days cycle). In LD10:62 conditions the SnoPer, SnoTim and SnoCyc mRNA, gives a peak on the and of scotophase. In L10:14D:10L: 62D conditions, the gene per and cycle gives a peak on the end of scotophase, while the genes tim and cry gives a peak after the second light. These results give a clue that circadian system is part of photoperiodic system. Future progress in understanding the Drosophila circadian pacemaker, particularly as further output components are identified, may provide a direct link between the clock and photoperiodism. B. The Heat Shock Proteins of S. nonagrioidesWe isolated and characterized two members of the α-crystalline/sHSP family, the SnoHsp19.5 and SnoHsp20.8 from the Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae). The cDNAs encoded proteins of 174 and 185 amino acids and calculated molecular weights of 19.5 and 20.8 kDa, respectively. The deduced amino acid sequence of SnoHsp19.5 showed the highest homology of 90% Hsp19.7 of Mamestra brassicae. The closest much of SnoHsp20.8 was with Bombyx mori Hsp20.4 at 83% identity. Genes expression of SnoHsp19.5 and SnoHsp20.8 under different environmental conditions (heat or cold), showed that in nondiapausing individuals, even though the transcripts were highly induced in response to heat shock, the accumulation after heat or cold treatment was different. In S. nonagrioides the expression of SnoHsp19.5 gene was consistently expressed in response to diapause and up regulated in stress conditions, while SnoHsp20.8 gene was down regulated in deep diapause and up regulated at the termination of diapause, marking the termination of the process. Our results suggesting suggesting that these genes may play distinctive roles in the regulation of the diapause process. The complete cDNA sequences of Heat shock cognate protein 70 (SnoHsc70) and Heat shock protein 70 (SnoHsp70) were also determined from the corn stalk borer Sesamia nonagrioides (Lef.). They encode 653 amino acids (Hsc70) and 633 amino acids (Hsp70), with calculated molecular masses of 71.5 kDa and 70.2 kDa respectively. SnoHsc70 is constitutively expressed, and SnoHsp70 is heat-inducible in non-diapausing insects. SnoHsp70 is down regulated during diapause, while SnoHsc70 is induced as the larvae enter deep diapause. High temperature stress during diapause has no further effect on transcript levels of SnoHsc70. Our results show that SnoHsc70 may play important roles in assisting protein conformation during specific stages of diapause.At the end, afull-length Hsp83, named SnoHsp83, cDNA from corn stalk borer Sesamia nonagrioides was cloned and sequenced. Genomic analysis showed that the SnoHsp83 gene is unique. The size of the SnoHsp83 mRNA was found to be approximately 2.6 kb. The deduced polypeptide comprised 717 amino acid residues, with a molecular mass of 82.6 kDa. It contains all the highly conserved amino acid motifs that characterize the cytosolic members of the hsp90 family. We investigated the expression of SnoHsp83 gene in response to diapause and heat/cold stress. SnoHsp83 is constitutively expressed in non-diapausing larvae and is induced to fifteen-fold by heat. SnoHsp83 display a similar pattern with SnoHsc70 under diapause conditions, when extra larval molts go through. Our results indicate that SnoHsp83 gene could be involved in the developmental process that occur between two molts.Η διάπαυση των εντόμων είναι μια περίοδος περιορισμού της ανάπτυξης που κατευθύνεται από αλλαγές σε αβιοτικά μηνύματα, τα οποία δείχνουν αλλαγές σε περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως είναι ο χειμώνας. Κατά τη διάρκεια της διάπαυσης, πολλά γονίδια δεν εκφράζονται, ενώ κάποια άλλα εκφράζονται και φαίνεται ότι αυτά σχετίζονται με ωρολογιακούς μηχανισμούς και με αντίσταση στις αντίξοες συνθήκες. Τα βιολογικά ρολόγια είναι μοριακοί μηχανισμοί μέτρησης του χρόνου τα οποία ανήκουν σε διάφορους τύπους κυττάρων των οργανισμών.Η πρόκληση της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διακρίνει τη σχέση μεταξύ εσωτερικών και εξωτερικών μηνυμάτων, τα οποία συνδυαστικά οδηγούν τα έντομα σε διάπαυση. Η D. melanogaster είναι ένα εξαιρετικό μοντέλο γενετικής, αλλά όχι κατάλληλο για να κατανοήσουμε οικολογικούς όρους, όπως είναι η διάπαυση. Το έντομο Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) έχει έναν αριθμό πλεονεκτημάτων, όπως είναι η προαιρετικού τύπου διάπαυση στο στάδιο της προνύμφης τελευταίου σταδίου (φωτοπερίοδος μικρής ημέρας, εισάγει διάπαυση, με εκτεταμένη διάρκεια ζωής της προνύμφης) και μπορεί να αποτελέσει ένα πολύ καλό μοντέλο για μελέτη της διάπαυσης. Τα αντικείμενα της παρούσας διατριβής είναι:Α. Η μελέτη των βιολογικών ρολογιών της S. nonagrioides.Β. Η μελέτη θερμοεπαγωγής στο έντομο S. nonagrioides.Α. Τα βιολογικά ρολόγια της S. nonagrioides τα εξετάσαμε ως κιρκαδικά και ως φωτοπεριοδικά ρολόγια. Για να μελετήσουμε το μοριακό μηχανισμό του κιρκαδικού ρολογιού της S. nonagrioides, απομονώσαμε από κεφάλια προνυμφών της τα ωρολογιακά γονίδια per, tim, cyc και cry και στη συνέχεια μελετήσαμε την έκφραση τους σε φωτοπερίοδο μεγάλης (16L:8D) και μικρής (10L:14D) ημέρας. Απομονώθηκε ένα cDNA 1630 bp (ημιτελές), το Snοper, που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 469 αμινοξέων και ένα cDNA 2803 bp, το SnοTim, που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 778 αμινοξέων. Δομικά, οι SnoPER και SnoTIM πρωτεΐνες κατέχουν κοινές ομολογίες με άλλα είδη εντόμων. Ιδιαίτερα υψηλά συντηρημένες περιοχές, οι PAS, PAC, NLS, CLD και TIS στην PER μεταξύ της S. nonagrioides και άλλων λεπιδοπτέρων, προτείνει ότι στην S. nonagrioides ο κιρκαδικός μηχανισμός λειτουργεί με όμοιο τρόπο, όπως στη Drosophila και σε άλλα λεπιδόπτερα. Επίσης κλωνοποιήσαμε δύο cDNA, που χαρακτηρίστηκαν ως Snοcry1 και Snοcry2. Το Snοcry1 cDNA έχει μέγεθος 1836 bp, ενώ το Snοcry2 cDNA έχει μέγεθος 741 bp. Το Snοcry1 είναι όμοιο με το cry1 της D. melanogaster. Το Snοcry1 κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο 528 αμινοξικών καταλοίπων. Η μοριακή μάζα της προβλεπόμενης πρωτεΐνης SnοCRY1 ήταν 59.6 kDa, και το υπολογισμένο ισοηλεκτρικό σημείο (pI) 8.33. Τέλος, απομονώσαμε το SnοCyc, που αποτελείται από 2412 bp και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 667 αμινοξέων. Η SnοCYC περιέχει μία bHLH περιοχή για πρόσδεση στο DNA, και τις PAS-A και PAS-B περιοχές διμερισμού. Για να εξετάσουμε εάν τα Snοper, Snοtim, Snοcyc και Snοcry μετάγραφα ταλαντεύονται σε 24ωρο κύκλο, εξετάσαμε τα επίπεδα των mRNA σε κεφάλια προνυμφών κάτω από συνθήκες φωτοπεριόδου LD10:14 και LD16:8, με την τεχνική του Real-Time PCR. Τα ωρολογιακά γονίδια Snοper, Snotim, Snοcry και Snοcyc στις χρονικές μελέτες σε S. nonagrioides προνύμφες, έδειξαν μια καθαρή κιρκαδική ταλάντωση και μια φωτοπεριοδική ανταπόκριση. Κάτω από συνθήκες μεγάλης ημέρας και τα τέσσερα γονίδια δείχνουν χαμηλότερη έκφραση την ημέρα και υψηλότερη τη νύχτα. Σε συνθήκες μικρής ημέρας και τα τέσσερα γονίδια έδειξαν επίσης μια καθαρή κιρκαδική ταλάντωση και μια φωτοπεριοδική ανταπόκριση, με μετατόπιση της κορύφωσης στο σκοτάδι, κατά 1-5 ώρες, σε σχέση με τις συνθήκες μεγάλης ημέρας. Tα μοριακά αποτελέσματα των πειραμάτων μας δείχνουν ότι η αλλαγή φωτοπεριόδου επηρεάζει άμεσα την mRNA έκφραση των ωρολογιακών γονιδίων.2. Ο στόχος αυτού του μέρους εργασίας μας είναι η μελέτη της σχέσης ανάμεσα στις λειτουργίες του φωτοπεριοδικού και του κιρκαδικού ρολογιού, στο μεταγωγικό μονοπάτι των φωτοπεριοδικών μηνυμάτων για την εκδήλωση προαιρετικής διάπαυσης. Ως μοντέλο χρησιμοποιήθηκε το έντομο S. nonagrioides. Εφαρμόστηκε σειρά πειραμάτων διαφορετικών φωτοπεριόδων σε ημερήσιο κύκλο (24 ώρες), τριήμερο κύκλο (72 ώρες) και τετραήμερο κύκλο (96 ώρες). Σε όλες τις περιπτώσεις που αναλύσαμε, πετύχαμε εισαγωγή των προνυμφών σε διάπαυση. Σε συνθήκες LD10:14 (24 ώρες) εμφανίστηκε ένας καθαρά 24ωρος ρυθμός των Snοper, Snοtim, Snοcry και Snocycle mRNA επιπέδων. Η έκφραση καταστέλλονταν κατά τη φωτόφαση και επάγονταν κατά τη σκοτόφαση. Τα επίπεδα mRNA των Snοper, Snocycle και Snοcry εμφανίζουν κορυφή την ίδια ώρα της σκοτόφασης, ενώ το Snοtim διαφέρει και εμφανίζει κορυφή τρείς ώρες αργότερα. Στη φωτοπερίοδο LD10:62 (τριήμερος κύκλος) εμφανίστηκε μια ταλάντωση των τεσσάρων γονιδίων και είδαμε μια κορυφή για όλα τα γονίδια, στο τέλος της σκοτόφασης. Σε συνθήκες L10:14D: 10L: 62D (τετραήμερος κύκλος) εμφανίστηκε μια ταλάντωση των mRNA επιπέδων των γονιδίων. Τα γονίδια Snοtim και Snοcry εμφανίζουν κορυφή στο μέσον της δεύτερης «υποκειμενικής νύχτας». Τα γονίδια Snοper και Snocyc εμφανίζουν κορυφή στο τέλος της σκοτεινής φάσης, πριν την έναρξη του φωτός του επόμενου κύκλου. Σε σχέση με τον τριήμερο κύκλο (10L: 62D), παρατηρούμε ότι η προσθήκη ενός 24ωρου κύκλου με φωτεινή φάση 10 ωρών, επηρεάζει τα γονίδια Snοtim και Snοcry και αλλάζει την εικόνα έκφρασης τους. Για τα γονίδια Snοper και Snocycle παρατηρούμε ότι δεν αλλάζει η εικόνα έκφρασης και η κορυφή συμπίπτει με την κορυφή του κύκλου LD10:62. Αυτό είναι μια ένδειξη ότι η κιρκαδικότητα και η φωτοπεριοδικότητα ρυθμίζονται από τα ίδια γονίδια. Σε σχέση με τα Snοtim και Snοcry, των οποίων αλλάζει η εικόνα έκφρασης, φαίνεται ότι έχουμε αποσύζευξη των συστατικών (γονιδίων) του μηχανισμού. Αυτό το γεγονός ίσως δείχνει ότι έχουμε 2 μηχανισμούς, που λειτουργούν όμως με τα ίδια ωρολογιακά γονίδια. Η έρευνά μας σε σχέση με τη φωτοπεριοδική διάπαυση της S. nonagrioides δίνει ενδείξεις ότι το κιρκάδιο σύστημα είναι μέρος του φωτοπεριοδικού συστήματος. Τα δύο συστήματα βασίζονται σε μοριακούς ωρολογιακούς μηχανισμούς των γονιδίων του κιρκαδικού ρολογιού.Β. Για τη μελέτη της θερμοεπαγωγής στο έντομο S. nonagrioides, απομονώσαμε, αναλύσαμε και μελετήσαμε την έκφραση σε συνθήκες μεγάλης και μικρής ημέρας (σε κρύο ή ζέστη) για τα heat shock γονίδια: SnoHsp19.5, SnoHsp20.8, SnoHsc70, SnoHsp70 και SnoHsp83. α. Απομονώσαμε και χαρακτηρίσαμε δύο μέλη της οικογένειας α-crystalline/sHSP, το SnoHsp19.5 και SnoHsp20.8 από τη S. nonagrioides. Τα cDNAs κωδικοποιούσαν πρωτεΐνες των 174 και 185 αμινοξέων, υπολογισμένου μοριακού βάρους 19.5 και 20.8 kDa, αναλογικά. Η προβλεπόμενη αμινοξική ακολουθία του SnoHsp19.5 έδειξε υψηλή ομοιότητα 90% με την Hsp19.7 της Mamestra brassicae. Η SnoHsp20.8 είχε 83% ομοιότητα με την Hsp20.4 του Bombyx mori. Η έκφραση των γονιδίων SnoHsp19.5 και SnoHsp20.8 κάτω από διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (ζέστη ή κρύο), έδειξε ότι άτομα που δεν ήταν σε διάπαυση, είχαν μετάγραφα τα οποία επάγονταν ισχυρά σε σχέση με θερμικό shock. Η συσσώρευση των μεταγραφημάτων μετά από θερμικό ή ψυχρό shock, ήταν διαφορετική για τα δύο γονίδια. Στο έντομο S. nonagrioides, η έκφραση του γονιδίου SnoHsp19.5 ήταν σταθερή σε σχέση με τη διάπαυση, όπου εκφράζονταν συνεχώς και έδειξε να επάγεται σε συνθήκες stress. Το γονίδιο SnoHsp20.8 δεν επάγονταν στη διάρκεια της βαθειάς διάπαυσης και επάγονταν κατά τον τερματισμό της διάπαυσης, σηματοδοτώντας τον τερματισμό της διαδικασίας αυτής. Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι τα γονίδια SnoHsp19.5 και SnoHsp20.8 ίσως παίζουν διακριτούς ρόλους στη διαδικασία της ρύθμισης της διάπαυσης.Απομονώθηκαν επίσης από το έντομο S. nonagrioides και χαρακτηρίστηκαν οι πλήρεις cDNA ακολουθίες της Heat shock cognate protein 70 (SnoHsc70) και Heat shock protein 70 (SnoHsp70). Αυτές κωδικοποιούν μία πρωτεΐνη 653 αμινοξέων (Hsc70) και 633 (Hsp70), με υπολογισμένη μοριακή μάζα 71.5 kDa και 70.2 kDa αναλογικά. Το γονίδιο SnoHsc70 εκφράζονταν συστατικά και το SnoHsp70 ήταν έντονα θερμοεπαγώμενο σε μη διαπαύοντα έντομα. Το SnoHsp70 δεν επάγεται στη διάρκεια της διάπαυσης, ενώ το SnoHsc70 επάγεται όταν οι προνύμφες εισέρχονται σε βαθειά διάπαυση. Υψηλό θερμικό stress κατά τη διάρκεια της διάπαυσης δεν επηρεάζει επιπλέον τα μεταγραφικά επίπεδα του SnoHsc70. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το γονίδιο SnoHsc70 ίσως παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια ειδικών σταδίων της διάπαυσης. Τέλος, απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε ένα πλήρες cDNA Hsp83 από τη S. nonagrioides, που ονομάστηκε SnoHsp83. Γονιδιωματική ανάλυση έδειξε ότι το γονίδιο SnoHsp83 είναι μοναδικό. Το μέγεθος του SnoHsp83 mRNA ήταν 2.6 kb. Το προβλεπόμενο πολυπεπτίδιο αποτελείται από 717 αμινοξικά κατάλοιπα, με μοριακή μάζα 82.6 kDa. Η πρωτεΐνη περιέχει όλα τα υψηλά συντηρημένα μοτίβα τα οποία χαρακτηρίζουν τα μέλη της οικογένειας hsp90. Μελετήσαμε την έκφραση του γονιδίου SnoHsp83 σε σχέση με διάπαυση και κρύο/ζέστη. Το SnoHsp83 ήταν συστατικά εκφρασμένο σε μη διαπαύουσες προνύμφες και επάγονταν κατά 15 φορές σε συνθήκες θερμοκρασίας 40ο C. To SnoHsp83 στη διάρκεια της βαθειάς διάπαυσης, όταν συμβαίνουν επιπλέον εκδύσεις, επιδεικνύει μια όμοια μορφή έκφρασης με το SnoHsc70. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το γονίδιο SnoHsp83 μπορεί να εμπλέκεται στην αναπτυξιακή διαδικασία η οποία διενεργείται ανάμεσα σε δύο εκδύσεις