Solid residues of agisultural products and agricultural industies as cell immobilization substrates for use of baker's

Research on the exploitation of agricultural and agro-industrial waste has been intensified over the last years. The prevalent tendency is the transformation of these wastes as fermentation substrates for growth and production of microorganisms, as well as for the production of new foods of high nutritional value and low cost. The use of immobilization method becomes more attractive, because it combines both of them. A large number of reports exists dealing with the exploitation of agro-industrial wastes as substrates for cell immobilization for the production of alcohol, beer and wine. Reports on the use of immobilization method in breadmaking have not been published so far. Likewise the present thesis has focused on the exploitation of solid orange residues, produced as wastes of orange juice factories and of spent grains of breweries in breadmaking. A model immobilized biocatalyst with high nutritional value was prepared, by immobilizing yeast cells in a Greek traditional cereal food called trahanas. This biocatalyst is considered as a new baker’s yeast and presents several advantages. The most important of which is the presence of lactic bacteria and yeasts, the high similarity with flour, which is the basic raw material of bread and its high nutritional value, due to its composition (starch, gluten and milk). Furthermore apple and orange fruits, which are rejected in the landfills, were also tested as fermentation substrates for the production of cellular biomass. In addition experimental observations led to investigation of the promoter effect of orange peel pieces in continuous and batch aerobic fermentations of molasses. At the first part of the experiments a mixture of wheat flour and sour milk was treated according to the method of the traditional Greek fermented food trahanas, and was used as model cereal-based support (starch-gluten-milk matrix) for co-immobilization of lactic acid bacteria and yeast for potential use in food production. Cell immobilization was verified by electron microscopy and by the efficiency of the immobilized biocatalyst for alcoholic and lactic acid fermentation at various temperatures. Fermentation times were low and ethanol production was high and stable, showing good operational stability of the biocatalyst and suitability for commercial applications. Finally, large amounts of lactic acid and volatile by-products were produced at all the studied temperatures, revealing potential application of the proposed biocatalyst in fermented food production or use as food additive, in order to improve nutritional value, flavour formation and preservation time. Additionally, another two biocatalysts were also prepared by immobilizing a commercial Saccharomyces cerevisiae strain (baker’s yeast) on orange peel pieces and brewer’s spent grains respectively, for use in alcoholic fermentation and potential use in fermented food applications. Cell immobilization was verified by electron microscopy and by the efficiency of the immobilized biocatalysts for alcoholic fermentation. In the case of orange peel pieces various carbohydrate substrates were used (molasses, raisin extracts) besides glucose, at various temperatures. Fermentation times in all cases were low and ethanol productivities were high, showing good operational stability of the biocatalysts and suitability for commercial applications. Respectable amounts of volatile by-products were produced at all the studied temperatures, revealing potential application of the proposed biocatalysts in fermented food applications. The second part of the experiments dealt with production of cellular biomass. At first, diluted orange and apple pulps were used for biomass production. The microorganisms that were used were baker’s yeast cells and kefir culture. The results were compared with those, resulting from aerobic fermentations of molasses, which is the classic substrate for the production of baker’s yeast in industry. The results were of great significance. Higher biomass yields, biomass concentrations and biomass productivities were achieved in all the cases of using fruits compared to molasses. Orange pulp gave higher biomass productivities compared to the apple pulp. On the other hand, apple pulp gave higher biomass yields. Using orange pulp with addition of baker’s yeast cells, the biomass productivity was almost double in comparison to molasses. In the case of apple pulp with baker’s yeast cells, the biomass yield was double than that using of molasses. In all the above experiments the use of baker’s yeast cells gave better results than those of the kefir culture. Furthermore improvements of growth rate and productivity in biomass production using orange peel as promoter were observed in batch aerobic fermentation. Daily biomass productivity and biomass yield respectively were found higher in batch aerobic fermentation in the presence of orange peel as promoter. A novel bioreactor for continuous aerobic fermentation of molasses was used and the suitability for baker’s yeast production using orange peel as promoter was proved. The continuous bioreactor was operated for 12 days, stored for 20 days at 10oC and operated again for another 13 days without any diminution of biomass productivity. The third part of the experiments focused in breadmaking by using the aforementioned biocatalysts. For comparison purposes, bread was also made by free cells of baker’s yeast. In addition, kefir culture was used immobilized in the solid orange residues and spent brewery grains. The leavening activity of the immobilized biocatalysts and kefir grains in lean dough and their efficiency to produce bread of good quality, in terms of loaf volume, flavour, texture and shelf life, was evaluated. The best rising was obtained in the case of kefir grains and of immobilized yeast cells on trahana. Two methods were used for breadmaking, the direct method and the traditional sourdough method. The results proved, that the breads prepared with the direct method from immobilized cells, had almost the same qualitative and quantitative characteristics with those of commercial bread, with the exception of immobilized yeast cells and kefir in spent grains. The above results were confirmed by sensory evaluations and analyses of volatile compounds with SPME-GC-MS. Immobilized trahanas and kefir culture gave the more satisfactory results. The breads that were prepared with the sourdough method had superior quality, as it appeared also from sensory evaluations, that were carried out. They had better texture, flavour and gave more volatile compounds compared to all breads that were prepared with the direct method. The best sourdoughs were those prepared by immobilized cells in trahana and by kefir culture. The breads that were made were better in quality and nutritional value and presented higher preservation times in terms of staling and molding. In conclusion, the immobilized cells, as well as kefir culture proved to be successful biocatalysts in breadmaking. Likewise, the development and exploitation of substrates, such as the solid orange residues and spent brewery grains for the production of novel baker’s yeast, could solve the enormous ecological problems, caused by their rejection in the environment.Οι έρευνες για την εκμετάλλευση γεωργικών και αγροτοβιομηχανικών απορριμμάτων έχουν ενταθεί τα τελευταία χρόνια. Η τάση, που επικρατεί είναι η χρήση αυτών των απορριμμάτων ως υποστρωμάτων ζύμωσης για ανάπτυξη και παραγωγή μικροοργανισμών, καθώς και για παραγωγή νέων τροφίμων υψηλής προστιθέμενης αξίας και χαμηλού κόστους. Η χρήση της μεθόδου της ακινητοποίησης είναι πολύ ελκυστική, επειδή συνδυάζει και τα δύο. Πολλές αναφορές υπάρχουν για την εκμετάλλευση απορριμμάτων σαν υποστρώματα ακινητοποίησης για την παραγωγή αλκοόλης, μπύρας και κρασιού. Aναφορές για χρήση της μεθόδου ακινητοποίησης στην παρασκευή άρτου δεν υφίστανται στην βιβλιογραφία. Για το λόγο αυτό, η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στην εκμετάλλευση των στερεών του πορτοκαλιού, που προέρχονται από τα απορρίμματα των εργοστασίων χυμοποίησης και των στερεών απορριμμάτων ζυθοποιίας στην παρασκευή άρτου. Συγχρόνως παρασκευάστηκε πρωτότυπος ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης υψηλής διατροφικής αξίας, με ακινητοποίηση κυττάρων σε τραχανά, για.να χρησιμοποιηθεί ως νέα ζύμη αρτοποιίας. Ο βιοκαταλύτης αυτός παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήματα. Τα σημαντικότερα εκ των οποίων, είναι η παρουσία γαλακτικών βακτηρίων και ζυμών, η μεγάλη διατροφική συγγένεια με το αλεύρι, που είναι η βασική πρώτη ύλη στην παρασκευή άρτου, καθώς και η υψηλή διατροφική του αξία, επειδή αποτελείται από άμυλο, γλουτένη και γάλα. Παράλληλα, εξετάστηκαν τα μήλα και τα πορτοκάλια, τα οποία απορρίπτονται στις χωματερές, σαν νέα υποστρώματα στην αερόβια παραγωγή κυτταρικής βιομάζας. Τέλος μελετήθηκε η επίδραση των στερεών πορτοκαλιού στις κινητικές παραμέτρους των αερόβιων ζυμώσεων μελάσας για παραγωγής ζύμης αρτοποιίας σε συνεχές και ασυνεχές σύστημα. Σε πρώτη φάση έγινε η παρασκευή νέου πρωτότυπου βιοκαταλύτη από ξυνισμένο γάλα και αλεύρι, σύμφωνα με την μέθοδο παρασκευής του παραδοσιακού τραχανά. Ο παραπάνω βιοκαταλύτης ήταν ακινητοποιημένος με ζύμη αρτοποιίας που προστέθηκε κατά την διαδικασία της ακινητοποίησης, αλλά και με γαλακτικά βακτήρια, που φέρει ο ίδιος προερχόμενα από το ξυνισμένο γάλα που παρασκευάστηκε. Η ακινητοποίηση αποδείχθηκε μέσω φωτογραφιών ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και μέσω επαναλαμβανόμενων παρτίδων αλκοολικής και γαλακτικής ζύμωσης. Οι χρόνοι ζύμωσης ήταν μικροί και η παραγωγικότητα αλκοόλης σχετικά υψηλή και σταθερή σε όλες τις θερμοκρασίες ζύμωσης. Ο νέος βιοκαταλύτης παρουσίασε ικανοποιητική λειτουργική σταθερότητα και παρήγαγε σημαντικές ποσότητες γαλακτικού οξέος και πτητικών παραπροϊόντων σε όλες τις παρτίδες ζύμωσης. Τα παραπάνω απέδειξαν την καταλληλότητά του στην παραγωγή ζυμώσιμων τροφίμων, καθώς και στην πιθανή χρήση του ως πρόσθετο για την αύξηση της διατροφικής αξίας, του αρώματος και του χρόνου συντήρησης των τροφίμων. Επιπρόσθετα δύο ακόμα βιοκαταλύτες παρασκευάστηκαν με ακινητοποίηση κυττάρων ζύμης αρτοποιίας σε στερεά του πορτοκαλιού και σε στερεά απορρίμματα ζυθοποιίας αντίστοιχα και εξετάστηκε η απόδοσή τους στην αλκοολική ζύμωση. Η ακινητοποίηση των κυττάρων αποδείχθηκε μέσω φωτογραφιών ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και από επαναλαμβανόμενες παρτίδες ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου γλυκόζης. Στην περίπτωση χρήσης των ακινητοποιημένων κυττάρων σε στερεά του πορτοκαλιού μελετήθηκε επιπλέον η ζύμωση μελάσας και εκχυλίσματος σταφίδας. Όλα τα συστήματα των ακινητοποιημένων βιοκαταλυτών παρουσίασαν ικανοποιητικά αποτελέσματα στις ζυμώσεις, με υψηλές τιμές σε μετατροπή και παραγωγικότητα σε αιθανόλη, καθώς και αποδεκτά ποσοστά πτητικών παραπροϊόντων. Αναφορικά με τις κινητικές παραμέτρους των ζυμώσεων, καλύτερος φορέας ακινητοποίησης αποδείχθηκαν τα στερεά του πορτοκαλιού. Η δεύτερη φάση της διατριβής εστιάσθηκε στην παραγωγή κυτταρικής βιομάζας. Αρχικά εξετάστηκαν αραιωμένοι πολτοί πορτοκαλιού και μήλου για παραγωγή κυτταρικής βιομάζας. Οι μικροοργανισμοί, που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κύτταρα ζύμης αρτοποιίας και kefir. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά, που προέκυψαν από αερόβιες ζυμώσεις μελάσας, που είναι το κλασσικό υπόστρωμα για την βιομηχανική παραγωγή ζύμης αρτοποιίας. Τα αποτελέσματα κρίθηκαν ικανοποιητικά. Συγκεκριμένα, μεγαλύτερες συγκεντρώσεις, αποδόσεις και παραγωγικότητες βιομάζας επιτεύχθηκαν στην περίπτωση χρήσης των φρούτων σε σύγκριση με την μελάσα. Ο πολτός πορτοκαλιού έδωσε υψηλότερες παραγωγικότητες βιομάζας από το μήλο. Από την άλλη μεριά ο πολτός μήλου έδωσε το υψηλότερες αποδόσεις βιομάζας. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση χρήσης του πολτού πορτοκαλιού με προσθήκη ζύμης αρτοποιίας, η παραγωγικότητα βιομάζας ήταν σχεδόν διπλάσια από αυτήν, που έδωσε η χρήση της μελάσας. Όταν χρησιμοποιήθηκε πολτός μήλου με ζύμη αρτοποιίας η απόδοση βιομάζας ήταν περίπου διπλάσια συγκριτικά με τη μελάσα. Σε όλες τις περιπτώσεις, η χρήση ζύμης αρτοποιίας έδωσε καλύτερα αποτελέσματα από το kefir. Παράλληλα, από πειραματικές παρατηρήσεις προέκυψε, ότι σε αερόβιες ζυμώσεις μελάσας παρουσία στερεών του πορτοκαλιού, παρατηρήθηκε αύξηση της τελικής συγκέντρωσης, της παραγωγικότητας και της απόδοσης βιομάζας, καθώς και του εκατοστιαίου ποσοστού μετατροπής. Επιπλέον τα στερεά του πορτοκαλιού δοκιμάστηκαν ως προωθητές σε συνεχή ζύμωση μελάσας για παραγωγή ζύμης αρτοποιίας. Ο βιοαντιδραστήρας λειτούργησε για 12 ημέρες, αποθηκεύτηκε στους 100C και επαναλειτούργησε για άλλες 13 ημέρες, χωρίς μείωση της παραγωγικότητας της βιομάζας. Το τρίτο μέρος της διατριβής εστιάζεται στην παρασκευή άρτων από τους προαναφερθέντες βιοκαταλύτες, αλλά και από ελεύθερα κύτταρα ζύμης αρτοποιίας. Επιπρόσθετα χρησιμοποιήθηκε kefir, καθώς και ακινητοποιημένα κύτταρα kefir σε στερεά του πορτοκαλιού και σε στερεά απορρίμματα ζυθοποιίας. Αξιολογήθηκε η διογκωτική ικανότητα και η αποδοτικότητα των βιοκαταλυτών στην παραγωγή άρτου καλής ποιότητας, αναφορικά με τον όγκο, το άρωμα, την υφή και τον χρόνο συντήρησης. Οι άρτοι παρασκευάστηκαν με την άμεση μέθοδο και τη μέθοδο του προζυμιού. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι οι άρτοι, που παρασκευάστηκαν με την άμεση μέθοδο από ακινητοποιημένα κύτταρα είχαν περίπου τα ίδια ποιοτικά χαρακτηριστικά με αυτά του εμπορικού άρτου, με εξαίρεση την περίπτωση των ακινητοποιημένων κύτταρων ζύμης αρτοποιίας και kefir σε στερεά απορρίμματα ζυθοποιίας. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν από οργανοληπτικούς ελέγχους και με ανάλυση των πτητικών ενώσεων των άρτων με SPME-GC-MS. Ο ακινητοποιημένος τραχανάς και το ελεύθερο kefir έδωσαν τα πιο ικανοποιητικά αποτελέσματα. Οι άρτοι, που παρασκευάστηκαν με την μέθοδο του προζυμιού ήταν ανώτερης ποιότητας, όπως φάνηκε και από τους οργανοληπτικούς ελέγχους, που διεξάχθηκαν, είχαν καλύτερη υφή, γεύση και έδωσαν περισσότερες πτητικές ενώσεις από όλους τους άρτους, που παρασκευάστηκαν με την άμεση μέθοδο. Τα προζύμια, που είχαν παρασκευαστεί από ακινητοποιημένα κύτταρα σε τραχανά και από kefir έδωσαν τους ποιοτικότερους άρτους με τους μεγαλύτερους χρόνους συντήρησης. Συμπερασματικά, τα ακινητοποιημένα κύτταρα ζύμης αρτοποιίας σε τραχανά και τα ακινητοποιημένα κύτταρα ζύμης αρτοποιίας και kefir σε στερεά πορτοκαλιού αντίστοιχα, καθώς και το kefir εξετάστηκαν επιτυχημένα στην παραγωγή άρτου. Παράλληλα αξιοποιώντας υποστρώματα, όπως τα στερεά πορτοκαλιού και τα στερεά απορρίμματα ζυθοποιίας για παρασκευή νέων ζυμών αρτοποιίας, δίνεται συγχρόνως λύση στα τεράστια οικολογικά προβλήματα, που προκαλεί η απόρριψή τους στο περιβάλλον