Study of Aspergillus and Penicillium sp. physiological characteristics and factors related to ochratoxin A production in food products

Some filamentous fungi of the genera Aspergillus and Penicillium are of high impact for food safety due to their ability to produce a toxic secondary metabolite, ochratoxin A (OTA). OTA is well known for its carcinogenic, immunosuppressive and teratogenic properties. OTA has also been extensively documented as a contaminant of a wide variety of foods including cereals, green coffee, spices, nuts, dried fruits, beer, wine, grapes, and grape juice. Following, a literature review on OTA and existing knowledge of three main ochratoxigenic fungi (Aspergillus westerdijkiae, A. carbonarius and Penicillium verrucosum) the objectives of the present thesis were: i) to study the effect of different ecophysiological factors such as pH, aw, microstructure (intrinsic factors), temperature (extrinsic factor), and initial inoculum level (implicit factors) on fungal growth and OTA production, ii) to develop kinetic or stochastic models by using the primary data in order to predict fungal growth and OTA production and validate the aforementioned models on different foodstuffs, iii) to correlate different evaluation methods regarding fungal growth (colony diameter, dry fungal biomass, and spores population) and OTA production (ELISA and HPLC analysis), and iv) to study potential biological (e.g., microorganisms- bacterial and yeast composites) or alternative methods (e.g., essential oils- vapor phase and enclosed in edible coatings) for fungal inhibition and OTA reduction. At preliminary stage (Chapter 3), the potential of the ELISA method in the determination of the produced OTA by A. westerdijkiae, A. carbonarius and P. verrucosum in Malt Extract Agar at different pH (3.9, 5.1, 5.9 and 6.8), aw (0.87, 0.93 and 0.99), and temperature (10, 15, 20, 25, 30 and 40°C) levels was evaluated, providing a rapid screening for the optimum and marginal conditions of OTA production. Moreover, selected samples were analyzed for OTA by HPLC in order to verify ELISA method. The knowledge of optimal and marginal levels of ecological factors in order to optimize post-harvest and storage of food products may significantly affect the production of OTA. Following this screening, the study was focused on food microstructure (e.g., liquid, semi-liquid, solid) (expressed as % w/v gelatin) and how it may affect growth and OTA production of A. carbonarius in combination with factors such as aw, pH and temperature (Chapter 4). The primary data were used in order to develop secondary (kinetic) models for growth and OTA production rates by A. carbonarius. Finally, the performance of the developed models was evaluated in food matrices of different viscosity such as jelly, custard and marmalade. The findings of this chapter may provide a basis for reliable assessment of the risk of fungal growth and OTA production in foods of different structural and rheological properties. At a next step, germination, fungal growth and OTA production kinetics of A. westerdijkiae, A. carbonarius and P. verrucosum single spores were evaluated on Malt Extract Agar of different pH and aw values, incubated at different temperatures (Chapter 5). Fungal growth was determined by measuring the radial growth rate (RGR) and time-to-visible growth (TTVG) of colonies resulting from single spores, while OTA production from individual colonies was also tested. Monte Carlo simulations (10000 iterations) were used to model TTVG and time for OTA detection of various spore populations, assuming that spores behave independently. Simulations agreed well with validation data, suggesting that these findings may be used for risk assessment of OTA production based on the variability in responses of individual spores. With respect to (micro)biological control, composites of yeast and bacterial isolates from fermented products were studied, in order to assess their ability to inhibit A. carbonarius growth and reduce OTA concentration in culture media and beverages (Chapter 6). The antagonistic effect of the above composites against A. carbonarius growth was studied in Synthetic Grape Medium of pH 3.5 and aw 0.98, 0.95, 0.92 after incubation at 25°C. Different combinations of initial inocula of bacteria or yeast composites and fungi were used, in order to study antagonism between microorganisms. Regarding the OTA reduction experiment, different inocula of bacteria and yeast composites were inoculated in liquid media of different pH (3.0, 4.0, 5.0, and 6.1 or 6.5) and initial OTA concentration (50 and 100 ppb) and beverages e.g., grape juice, red wine, and beer to estimate the kinetics of OTA reduction. Fungal inhibition and OTA reduction were calculated in comparison to control samples. Such findings may assist in the control of A. carbonarius growth and OTA production in fermented foodstuffs by the use of proper strains of technological importance. Finally, given that ochratoxigenic fungi contaminate fruits through damaged or wounded tissues and release toxin under improper storage conditions, essential oil (EO) of cinnamon was used as natural antimicrobial agent (Chapter 7). Skin (intentionally wounded by puncturing) and flesh of apples and pears were used as substrates for A. carbonarius growth and OTA production. The EO activity was estimated through direct (addition in alginate coatings) and indirect (volatile compounds of cinnamon EO) contact with the fruits. Samples without any treatment served as controls. All samples were stored at 15, 20 and 25°C. Fungal growth was estimated by colony diameter measurements and spores density (log spores/ g) on MEA, while OTA production was determined by HPLC. The findings of the present PhD thesis may contribute to the better understanding of hazards such as growth and OTA production of A. westerdijkiae, A. carbonarius and P. verrucosum, to enforce the already existing prevention strategies and to deliver several new insights and tools (mathematical models) which may be useful for food safety management of fungal growth and OTA production by constituting also a fuel for further study and research.Στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν α) η σύγκριση-συσχέτιση διαφορετικών μεθόδων εκτίμησης της παραγωγής ΩΤΑ (ELISA και HPLC), β) η μελέτη της επίδρασης διαφορετικών οικολογικών παραγόντων π χ pH, aw, μικροδομή, θερμοκρασία και αρχικό επίπεδο ενοφθαλμίσματος στην ανάπτυξη των A westerdijkiae, A carbonarius και Ρ verrucosum και την παραγωγή ΩΤΑ, γ) η ανάπτυξη μοντέλων κινητικής και μοντέλων πιθανοτήτων στοχεύοντας στην πρόβλεψη της ανάπτυξης των μυκήτων και της παραγωγής ΩΤΑ και στην επικύρωση των αναπτυχθέντων μοντέλων σε διαφορετικά τρόφιμα και δ) η μελέτη και ανεύρεση πιθανών βιολογικών (χρήση μικροοργανισμών) ή εναλλακτικών μεθόδων (χρήση αιθέριων ελαίων) αναστολής της ανάπτυξης του A carbonarius ή μείωσης της ΩΤΑ. Κατά τη σύγκριση των δύο μεθόδων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης της ΩΤΑ, ELISA και HPLC, συμπεραίνεται ότι η ELISA μπορεί να αποτελέσει μία αξιόπιστη μέθοδο για ταχύ ημι-ποσοτικό προσδιορισμό της ΩΤΑ από τα τρία είδη μυκήτων κατά την ανάπτυξη τους σε θρεπτικά υποστρώματα υπό διαφορετικές τιμές pH (3 9-6 8), aw (0 87-0 99), και θερμοκρασίας (10-40°C) Παράγοντες όπως η aw και η θερμοκρασία ήταν οι καθοριστικότεροι για την παραγωγή ΩΤΑ Μελετώντας την επίδραση της μικροδομής, διαπιστώθηκε ότι αυξανόμενης της συγκέντρωσης της ζελατίνης (0-20% κ ό ), η ανάπτυξη του A carbonarius και η παραγωγή ΩΤΑ αναστέλλεται σημαντικά Επίσης, παρατηρήθηκε ικανοποιητική συμφωνία ανάμεσα στις προβλέψεις του ρυθμού ανάπτυξης και τις πειραματικές μετρήσεις σε τρόφιμα διαφορετικού ιξώδους και aw Αντίθετα, η μοντελοποίηση του ρυθμού παραγωγής ΩΤΑ αποδείχθηκε δυσκολότερη Η μελέτη της επίδρασης του αρχικού ενοφθαλμίσματος κατά την εκβλάστηση μεμονωμένων σπορίων αλλά και την ανάπτυξη και παραγωγή ΩΤΑ, αποικιών προερχόμενων από μεμονωμένα σπόρια των τριών μυκήτων σε διαφορετικές συνθήκες pH (3 5 και 5 5), aw (0 99 και 0 94) και θερμοκρασίας (10-30°C) έδειξε ότι παράμετροι όπως ο χρόνος εμφάνισης της μυκηλιακής υφής (TTVG) και ο χρόνος κατά τον οποίο η ΩΤΑ καθίσταται ανιχνεύσιμη (tdet 0ΤΑ) παρουσιάζουν αυξημένη παραλλακτικότητα κοντά σε οριακές συνθήκες Η στοχαστική προσέγγιση (προσομοίωση Monte Carlo) που αναπτύχθηκε περιέγραψε ικανοποιητικά την παραλλακτικότητα των δύο παραμέτρων για τα τρία είδη μυκήτων συναρτήσει των περιβαλλοντικών συνθηκών Επιπλέον βασικός στόχος ήταν η ανεύρεση βιολογικών μεθόδων αναστολής της ανάπτυξης των μυκήτων ή/ και μείωσης της παραγωγής ΩΤΑ Συγκεκριμένα, η προσθήκη μικτών καλλιεργειών ζυμών αποδείχθηκε ικανή για αναστολή της ανάπτυξης του Α carbonarius και μείωση της ΩΤΑ συγκριτικά με την χρήση βακτηρίων, σε υγρά θρεπτικά υποστρώματα (>65% μείωση ΩΤΑ) και ποτά όπως χυμός σταφυλιού, κρασί και μπύρα (>32% μείωση ΩΤΑ) Ως εναλλακτική μέθοδος μελετήθηκε και η άμεση (εδώδιμες επικαλύψεις) ή έμμεση (πτητικά συστατικά) εφαρμογή αιθέριου ελαίου κανέλας (0 3% και 0 9%) στη σάρκα και το φλοιό μήλων και αχλαδιών, ενοφθαλμισμένων με A carbonarius Η αναστολή τόσο στην ανάπτυξη όσο και στην παραγωγή της ΩΤΑ ήταν δραστικότερη στην περίπτωση των εδώδιμων επικαλύψεων