Fabrication and C-Reaction Protein Testing of a Piezoresistive Microcantilever Beam Biosensor

疾病問題一直是人類重要課題之ㄧ，尤以生物分子間鍵結情形為基礎之檢測技術更是佔有一席之地，透過不同生物指標可以準確檢測出可能發生之疾病以達到及時診斷之目的，其中C-反應蛋白( C-reaction protein，簡稱CRP )在近幾年應用相當廣泛，在急診臨床的診斷或是心血管疾病風險的評估，都有相當重要的發展。隨著奈米生物技術日趨成熟，微生物感測器近幾年逐漸取代佔有空間大、所需成本過高的傳統檢測系統，成為量測C-反應蛋白的最佳利器。 而目前市面上微生物感測器大多仍需使用化學或是螢光標記之方式，為此本研究選用以力學為基礎的微懸壁梁式生物感測器做為檢測機制，且為了避免傳統光學式微懸臂梁感測器需架設複雜光場及容易受到環境影響所造成的檢測誤差，而選用壓阻式微懸臂樑生物感測器(Piezoresistive micro-cantilever biosensor)進行實驗。本研究利用生物固定化的技術將抗體固定在微懸臂量上，並透過專一性使相對應的抗原與抗體結合，抗原抗體間鍵結時由於表面應力改變造成懸臂梁彎曲，此時懸臂梁中之壓阻阻值也會隨之改變，因此在實驗架構上配合惠司通電橋作為轉換機制，將抗原抗體結合反應透過壓阻效應轉換為電壓訊號，經由後端電路放大器等處理將訊號傳出到電腦分析。本研究使用C-反應蛋白作為生物指標，量測不同C-反應蛋白抗原濃度下造成訊號之差異，並探討不同溫度下壓阻式微懸臂梁生物感測器反應區內溫度之變化及溫度對於壓阻式微懸臂梁的輸出訊號影響，以其能使壓阻式微懸臂梁生物感測器系統準確率達到最佳化。C-reaction protein( CRP ) is becoming one of important biomarkers in cardiovascular disease, myocardial infarction( MI ), and atherosclerosis. Higher concentration of CRP in serum elevates the risk of those diseases. Despite of existing techniques of surface plasmon resonance( SPR ), enzyme-linked immunosorbent assay( ELISA ) and others developed, the present piezoresistive microcantilever biosensors are sensitive, potentially inexpensive, label-free and of ease-of-use in miniaturization. To be detected, the microcantilevers are placed inside a microfluidic system that has a volume of several ten microliters. As probed biomolecules are transported onto a sensing surface of microcantilevers, specific recognition occurs, resulting in biomolecular conformation change and associated nanomechanic deflection of induced surface stresses. The deflection is mostly detected by an optical lever of detection system. Despite sensitive detection, the entire optical measurement is bulky and hardly aligned in readout system. For biomolecular recognition, the piezoresistive cantilever is required for operation in a phosphate buffered saline solution or human plasma which is to maintain a specific pH environment of a strong electrolyte. As a result of device electrical insulation to its solution, the piezoresistive cantilever is required to be surrounded by the insulating material to prevent electric leakage and unwanted chemical reaction on the sensing surface. The selected silicon nitride is used to conform to the requirements for the insulting material. The cantilevers are designed in 150 or 200 μm long, 50 μm wide and about 1.4 μm thick. The integrated piezoresistive resistors are 100 μm long, 50 μm wide and 200 nm thick, and the expected resistance is approximately 4 kΩ. Meanwhile, the gold layer (30 nm thick) coated on the cantilever surface is necessary for chemical reaction of biolinker, and thus the sensing surface of specific protein adsorption and its associated recognition. Preliminary result of CRP detection was obtained by this piezoresistive microcantilever. The device is confirmed to be tested in solution environment and thus its preliminary feasibility. More testing is required for further verification in CRP detection.摘要 I Abstract II 謝誌 IV 目錄 VI 圖目錄 VIII 表目錄 XII 符號目錄 XIII 第一章 序論 1 1-1 前言 1 1-2 研究動機及目的 3 1-3 文獻回顧 4 1-3-1 C-反應蛋白在心血管疾病上之意義 4 1-3-2 微懸臂梁式生物感測器於生化檢測之應用 8 1-4 論文大綱 13 第二章 生物感測器 15 2-1 生物感測器之基本原理 15 2-2 生物感測器之分類 17 2-3 辨視分子層的固定化技術 20 2-4 生物分子間之辨識 21 2-5 免疫反應中抗原抗體的專一性鍵結 24 2-5-1 免疫反應之介紹 24 2-5-2 抗體之介紹 26 2-5-3 抗原抗體間專一性鍵結 28 2-6 C-反應蛋白 29 2-6-1 C-反應蛋白結構 29 2-6-2 C-反應蛋白特性 29 2-6 微懸臂梁式生物感測器 31 2-6-1 微懸臂梁轉換機制 31 2-6-2 微懸臂梁生物感測器彎曲機制 36 2-6-3 微懸臂梁生物感測器量測方式 38 第三章 壓阻式微懸臂梁生物感測器 40 3-1 壓阻材料特性及分析 40 3-1-1 壓阻因子 40 3-1-2 壓阻係數 45 3-2壓阻效應分析 46 3-3壓阻式微懸臂梁電路分析 50 3-3 壓阻式微懸臂梁雜訊分析 52 第四章 壓阻式微懸臂梁生物感測器之設計與製作 57 4-1 微懸臂梁生物感測晶片之設計與製作 57 4-1-1 壓阻之設計 57 4-1-2 微懸臂梁生物感測晶片之設計與規格 59 4-1-3 微懸臂梁生物感測晶片之製作流程 60 4-2 微流道之設計與製作 64 4-2-1 微流道之設計 64 4-2-2 微流道之製作流程 65 4-3 後端電路設計與規格 69 4-3-1 後端電路設計 69 4-4 晶片設計與組裝 79 第五章 實驗架構與結果討論 82 5-1 實驗架設 82 5-2 實驗流程 85 5-2-1 實驗方法 85 5-2-2 實驗步驟 86 5-3 實驗結果與討論 88 5-3-1問題與討論 88 5-3-2 實驗結果 94 第六章 結論與未來展望 105 6-1 結論 105 6-2 未來展望 106 參考文獻 10