Cell- and molecular-biological research of the photo- and polarotropism of the mosses Ceratodon purpureus and Physcomitrella patens

Titel Danksagung 5 Abkürzungen 6 Inhaltsverzeichnis 8 1 Einleitung 14 1.1 Lichtwahrnehmung bei Pflanzen 14 1.2 Phytochrome 15 1.3 Phytochrom-gesteuerter Phototropismus in Cryptogamae 24 1.4 Ceratodon purpureus als Modellorganismus für den Phototropismus 25 1.5 Reverse Genetik in Pflanzen 31 1.6 Ziele der Arbeit 39 2 Material und Methoden 41 2.1 Pflanzenmaterial 41 2.2 Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie 43 2.3 Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie 43 2.4 Bakterienstämme 44 2.5 Hefestämme 44 2.6 Puffer und Lösungen 44 2.7 Mikroinjektion 50 2.8 Reinigung von Phycocyanobilin aus Spirulina geitleri durch Methanolyse 53 2.9 Expression und Affinitäts-Chromatographie von Ceratodon-Phytochrom CerpuPhy2His in Saccharomyces 55 2.10 DNA-Isolierung aus Ceratodon 56 2.11 Klonierung von DNA-Fragmenten 58 2.12 Transformation von Ceratodon purpureus 69 2.13 Southern Blot-Analyse 72 3 Ergebnisse 75 3.1 Wiederherstellung aphototroper Ceratodon-Mutanten durch Mikroinjektion von Phycocyanobilin 75 3.2 Mikroinjektion von Hämoxygenase-Genen 79 3.3 Lokalisierung von CpHO1 83 3.4 Injektion von CerpuPhy2 85 3.5 Phototropismus von Physcomitrella patens 90 3.6 Gene targeting in Ceratodon purpureus 107 4 Diskussion 121 4.1 Wiederherstellung aphototroper Mutanten über Mikroinjektion 121 4.2 Phototropismus und Polarotropismus von Physcomitrella patens: Antworten des Wildtyps 126 4.3 Phototropismus von Physcomitrella-Phytochrom knockout-Linien 129 4.4 Gene targeting in Ceratodon purpureus 131 5 Zusammenfassung 136 Summary 138 6 Literaturverzeichnis 140 7 Anhang: Sequenzierung der gene replacement-Mutanten 155 7.1 CpHO1 von G23#G4 155 7.2 CpHO1 von G23#C1 156 8 Publikationen 157 9 Curriculum vitae 159Auf zellulärer und molekularer Ebene wurde die Photomorphogenese in den Moosen Ceratodon purpureus und Physcomitrella patens untersucht. Phycocyanobilin, welches den Phytochrom-Chromophor Phytochromobilin substituiert, wurde in einzelne Protonema-Spitzenzellen aphototroper Ceratodon-Mutanten injiziert. Dieses führte in ~70 % der injizierten Zellen zu deutlichen phototropen Antworten und einer Erhöhung des Chlorophyll-Gehaltes nach Bestrahlung mit Rotlicht. Die Untersuchungen geben Hinweise auf eine extrem stabile Subfraktion an Holophytochrom, die scheinbar an der Apex der Spitzenzelle lokalisiert ist. Injektionen von Expressionsplasmiden mit Hämoxygenase-Genen aus Ratte, Arabidopsis und Ceratodon (CpHO1) zeigten, dass den Mutanten eine Aktivität dieses Enzyms fehlt. In ~40 % der injizierten Filamente wurde der Wildtyp-Phänotyp wiederhergestellt. Über ein GFP-CpHO1-Fusionsprotein wurde gezeigt, dass das Enzym in den Chloroplasten lokalisiert ist. Sowohl plastidär als auch cytoplasmatisch lokalisierte Enzyme unterdrückten den Phänotyp der Mutanten. Ziel der Untersuchungen mit Physcomitrella war die Identifikation photorezeptorvermittelter Antworten. Es wurden Bedingungen etabliert, unter denen Protonema-Wachstum im Dunklen induziert wird. Die Befunde deuteten an, dass die Adaptation an einen gravitropen Stimulus dafür eine Vorraussetzung ist. Physiologische Untersuchungen mit dunkeladaptierten Protonemen identifizierten phytochromvermittelten Phototropismus. Fluenz-Effekt-Kurven der phototropen Antwort vermittelten ein komplexes Bild. Abhängig von der Bestrahlungsstärke reagierten Protonemen positiv und/oder negativ phototrop. Experimente mit polarisiertem Licht deuteten an, dass aktive Phytochrom- Moleküle in Physcomitrella dichroitisch orientiert in enger Nachbarschaft zur Plasmamembran lokalisiert sind. Der quantitative Vergleich des phototropen Verhaltens des Wildtyps mit knockouts der Phytochromgene PhypaPhy1-4 lieferte ein detailliertes Bild der Funktion der vier Phytochrome. Jedes übernimmt eine spezifische Rolle der phototropen Antwort. In PhypaPhy4-knockouts ist der positive Phototropismus vollständig unterdrückt. PhypaPhy1-4 wurden von Franz Mittmann durch homologe Rekombination ausgeschaltet (2003). Der leicht zu identifizierende Phänotyp der aphototropen Ceratodon-Mutanten wurde zur Untersuchung von gene targeting-Experimenten in diesem Organismus genutzt. Transformationen mit knockout-Konstrukten, welche das CpHO1-Gen im Wildtyp zum Ziel hatten, resultierten in ~40% der regenerierten Protoplasten im aphototropen Phänotyp. Überraschenderweise wurde dieser Phänotyp nicht durch Integration des knockout-Konstruktes am homologen genomischen Locus erzielt, beruht aber allem Anschein nach auf der homologen DNA. In der Mutante ptr116 liegt die Ursache in einer Punktmutation in CpHO1 (Mittmann, 2003). Mit einem modifizierten CpHO1-Genfragment wurde das defekte Gen über homologe Rekombination repariert. PCR- und Southern-Analysen zeigten die Integration eines einzelnen Fragments im homologen Bereich des Ceratodon-Genoms und belegten erfolgreiches gene replacement. Erstmalig wurde somit das replacement eines pflanzlichen Kern-Gens durchgeführt. Darüber hinaus wurde mit diesem Experiment auf elegante Weise gezeigt, dass in Ceratodon pupureus effizientes gene targeting durch homologe Rekombination möglich ist.During the work for this thesis cellular and molecular approaches were used to study photomorphogenesis in the mosses Ceratodon purpureus and Physcomitrella patens. Phycocyanobilin, which substitutes for the phytochrome chromophore phytochromobilin, was injected into protonema tip cells of aphototropic Ceratodon mutants. This led in ~70 % of the filaments to a clear phototropic response and elevated chlorophyll levels in red light. The studies implied the existence of an extreme stable subfraction of holophytochrome, localized apparently to the apex of the tip cell. Injections of expression plasmids carrying for heme oxygenase genes from rat, Arabidopsis and Ceratodon (CpHO1) indicate that the mutants lack the enzymic activity of this gene product. In ~40 % injected filaments the wildtype phenotype could be restored. A GFP-CpHO1 fusion protein expressed from an appropriate plasmid showed that the enzyme is localized to the plastids. However, both plastidic and cytosolic enzymes were able to suppress the mutant phenotype. The work presented here was intended to shed light on light-mediated responses in Physcomitrella. Conditions were established under which Physcomitrella protonemal filaments grow in darkness. It seems that the adaptation to a gravitropic stimulus is a prerequisite for dark growth of Physcomitrella protonema. Physiological studies charcterised phytochrome-mediated phototropism in protonemata. Fluence response curves of caulonemal phototropism in red light are rather complex. Depending on the fluence rate, filaments grew positively and/or negatively phototropically. Experiments with polarized light indicate that phytochrome molecules in Physcomitrella are dichroically orientated in close vicinity to the plasma membrane. A quantitative comparison of the phototropic behavior of the wildtype with that of knockouts of the four phytochrome genes PhypaPhy1?4 provided a detailed picture of the function of each of the four genes. It appears that each phytochrome has a specific role in the phototropic response. In PhypaPhy4-knockouts positive phototropism is lost completely. PhypaPhy1?4 were disrupted via targeted knockout by Franz Mittmann (2003). The easily identifiable phenotype of aphototropic Ceratodon mutants was the basis for gene targeting experiments in this organism. Transformations with a knockout construct directed against the CpHO1 gene in the wildtype resulted in ~40% of the regenerating protoplasts showing the aphototropic phenotype. Surprisingly however, this was not the result of the expected integration of the construct at the homologous genomic locus, but probably of the homologous DNA. The cause of the mutant ptr116 is a point mutation in CpHO1 (Mittmann, 2003). A plasmid carrying a modified CpHO1 gene fragment was transfected into mutant protoplasts in an attempt to repair the lesion via homologous recombination. PCR- und Southern-analysis?s supplied evidence for the integration of a single fragment at the homologous region in the Ceratodon genome providing unambiguous evidence of successful gene replacement. This is the first report of a nuclear gene replacement in plants. Moreover this experiment has shown in an elegant manner that efficient gene targeting by homologous recombination is possible in Ceratodon purpureus