A biochemical analysis of the prokaryotic phytochromes Cph1 from Synechocystis PCC6803 and Agp1 from Agrobacterium tumefaciens

Titelblatt, Danksagung, Abkürzungen, Inhaltsverzeichnis 1\. Einleitung 2\. Material und Methoden 3\. Ergebnisse 4\. Diskussion 5\. Literaturverzeichnis 6\. Anhang 7\. PublikationenInnerhalb dieser Doktorarbeit wurden biochemische und strukturelle Eigenschaften des cyanobakteriellen Phytochroms Cph1 aus Synechocystis PCC 6803 und des proteobakteriellen Phytochroms Agp1 aus Agrobacterium tumefaciens untersucht. Cph1 und Agp1 sind Chromoproteine, welche als lichtregulierte Kinasen zu einem Zwei-Komponenten-System gehören. Zu Beginn wurde die Löslichkeit des in E.coli exprimierten Cph1 sowohl durch die Optimierung des Zellwachstums und der Proteinexpression als auch durch die Verwendung von Detergenzien und Gelfiltrationschromatographie (GFC) verbessert. Nach der Optimierung der Reinigung erreichte der Specific Absorbancen Ratio (SAR: Verhältnis zwischen Absorption bei λmax der Pr-Form und der Absorption bei 280 nm) einen Wert von 1.0. Dieser Wert ist proportional zum Verhältnis Chromophor / Protein. Bei Pflanzenphytochromen, aber auch bei Cph1 und Agp1 entspricht ein SAR von 1 oder größer einer guten Präparation. Konformationsänderungen zwischen Apoprotein sowie der Pr und Pfr Form wurden mittels analytischer GFC detektiert. PCB-Cph1 eluierte in dem Molekulargewicht eines Dimers (210-250 kDa). Durch native Gelelektrophorese (NGE) wurde PCB-Cph1 als Monomer (110-145 kDa) gereinigt. NGE-gereinigtes Cph1 war anfällig für Proteolyse und zeigte keine Autophosphorylierungsaktivität. Die Vermutung, dass Cph1 durch alkalische Bedingungen monomerisiert, wurde mittels GFC bestätigt. Cph1 wird dann anders gefaltet, so dass keine Dimerisierung mehr möglich ist, das Protein aber photostabil bleibt. Um lichtinduzierte Konformationsänderungen zu untersuchen, wurde limitierte Proteolyse mit verschiedenen Proteasen durchgeführt. In diesen Studien wurden Pr und Pfr unterschiedlich geschnitten. Von sechs dominanten Chromopeptiden (F1 bis F6) wurden die Molekulargewichte, die Sequenzen und damit die spezifischen Schnittstellen mittels Massenspektrometrie bestimmt. Die Fragmente F1 (S56-R520), F4 (T17-N449) und F5 (T17-E335) wurden bevorzugt in der Pfr-Form gebildet, während die Fragmente F2 (T64-R472), F3 (L81-R472) und F6 (T17-E323) vorzugsweise in der Pr-Form gebildet wurden. Die proteolytischen Untersuchungen des Cph1 zeigten ein R520, welches nach Photokonversion zu Pfr stärker exponiert wurde. Die Gelenkregion, in der R520 liegt, trennt das kompaktere N-terminale Chromophormodul vom weniger kompakten C-terminalen Histidinkinasemodul. Außerdem ist diese N-terminale Region bei der Pfr-Form kompakter als bei der Pr-Form. Die Region zwischen GAF- und PHY-Domäne wurde nach der Photokonversion zur Pr-Form stärker exponiert. Die Proteolyse nach NGE zeigte, dass die Dimerisierung das Ende der PHY-Domäne und die PAS-Domäne schützt. Drei Schnittstellen, E323, R470 und R520, wurden durch site-directed Mutagenese (SDM) verändert. In allen Mutanten war das Pr/Pfr Phosphorylierungsmuster qualitativ und quantitativ anders als bei dem Wiltyp, in allen Fällen wirkte sich die Mutation negativ auf die Lichtregulation der Autophosphorylierung aus. Die Phosphorylierungsergebnisse der Mutanten R472P, E323P und E323D implizierten, dass die Histidinkinaseaktivität des Cph1 aktiv in der Pfr-Form inhibiert wird. Schließlich wurden zwei N-terminale Deletionsproteine (Cph1:1-323 und Cph1:17-323) in E.coli exprimiert. Cph1:17-323 entsprach dem kleinen Chromofragment (F6), welches bei dem V8-Verdau gebildet wurde, während Cph1:1-323 die in F6 fehlenden ersten N-terminalen 16 Aminosäuren enthielt. Die Proteine assemblierten mit PCB und waren photoaktiv. Die Deletion der ersten 16 Aminosäuren zeigte, dass ein N-terminales 2 kDa Peptid wichtig für eine korrekte Assemblierung des Chromophors ist. Das Phytochrom Agp1 wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal biochemisch und spektral charakterisiert. Agp1 wurde mit den Chromophoren PCB, PEB und BV assembliert. Im Unterschied zu pflanzlichen Phytochromen und Cph1 assembliert Agp1 auch mit BV. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass BV an ein Cystein bindet. In darauf aufbauenden Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der Chromophor an ein konserviertes Cystein im N-Terminus (außerhalb der GAF-Domäne) bindet. Für BV-Agp1 wurde eine relativ ineffiziente Pfr-Pr Photokonversion festgestellt. Die Pfr-Form war nicht stabil im Dunkeln und revertierte zur Pr-Form. Die lichtregulierte Autophosphorylierung des Agp1 und die aktive Phosphatübertragung zu dem Responsregulator Rap1 wurde nachgewiessen. Wie bei den cyanobakteriellen Phytochromen war die Phosphorylierung in der Pr-Form stärker als in der Pfr- Form. Interessanterweiser war die Phosphorylierung des Apoproteins stärker als die des Holoproteins.The aim of this thesis was to examine the biochemical and structural properties of the cyanobacterial phytochrome Cph1 from Synechocystis PCC 6803 and the proteobacterial protein Agp1 from Agrobacterium tumefaciens, respectively. Cph1 and Agp1 are chromoproteins, which are typical light- regulated histidin kinases, and belong to a two-component-system. Initially, the solubility of the Cph1 protein expressed in E.coli was improved by determining the cell growth and protein expression as well as by employing detergents and a preparative SEC (size exclusion chromatography) for protein purification. After optimising of the purification procedure the Specific Absorbance Ratio (SAR) achieved a value of 1.0. Conformational changes of the holoprotein during chromophore assembly and the Pr-Pfr-photoconversion were detectable by analytical SEC. PCB-Cph1 eluted in the molecular weight range of a dimer (210-250 kDa), whereas apoprotein eluted as a monomer. By native gel electrophoresis (NGE) PCB-Cph1 was purified as monomer (110-145 kDa). Cph1 purified by NGE was prone to proteolysis and did not show autophosphorylation activity. The hypothesis that Cph1 becomes a monomer in alkaline conditions could be confirmed by alkaline SEC. Under these conditions, Cph1 is folded differently, thus prohibiting dimerization, but leaving the protein photostable. In order to analyse photoinduced conformational changes taking place during photoconversion of Cph1, limited proteolysis with a range of different proteases was performed. In these studies, Pr and Pfr were cleaved differently. The molecular weight, the sequences and thus the specific cleavage sites of six predominant chromopeptides (F1 to F6) were determined by mass-spectrometry. The fragments F1 (S56-R520), F4 (T17-N449) and F5 (T17-E335) appeared predominantly in the Pfr-Form , whereas the fragments F2 (T64-R472), F3 (L81-R472) and F6 (T17-E323) were produced preferentially in the Pr-Form. The proteolytical analysis of Cph1 showed a R520, which was more exposed in the Pfr-form. The hinge region, to which R520 belongs, divides the more compact N-terminal chromophore-module from the less compact C-terminal histidine kinase-module. Also, this N-terminal region is more condensed in the Pfr- than in the Pr-form. Secondly, the region between the GAF- and the PHY- domain becomes more exposed after the photoconversion of Cph1 to the Pr- conformation. Proteolysis after NGE implicated that the dimerisation protects the end of the PHY- and the PAS-domain. Three cleavage sites (E323, R470, R520) were mutated to two different amino acids by site-directed mutagenesis. In all mutants, the Pr/Pfr phosphorylation pattern was quantitatively different compared to the wildtype. The phosphorylation experiments with these mutants demonstrated a negative effect on the light-regulated autophosphorylation. Our results with the mutants E472P, E323P and E323D indicated, that the histidin-kinase activity of Cph1 is actively inhibited in the Pfr-conformation. Finally, two N-terminal deletion mutants of (Cph1:1-323 und Cph1:17-323) were expressed in E.coli. Cph1:17-323 corresponded to the smaller chromofragment (F6) produced by the V8 digest , whereas Cph1:1-323 contained the first 16 N-terminal aminoacids (aa) missing in F6. The proteins assembled with PCB and were photoactive. The deletion of the first 16 N-terminal aa showed the importance of a N-terminal 2 kDa peptide for the correct assembly of the chromophore. The phytochrome Agp1 has been characterised biochemically and spectrally for the first time by this work. Agp1 was assembled with the chromophores PCB, PEB and BV. In contrast to plant phytochromes and Cph1, Agp1 also assembles with BV. In this work, I was able to show that BV binds to a cysteine. In subsequent experiments, the binding of the chromophore to a conserved cysteine in the N-terminal region outside the GAF-domain could be demonstrated. BV-Agp1 displayed a relatively inefficient Pfr-Pr photoconversion. The Pfr-form was unstable in the dark and reverted to Pr-form. The light-regulated autophosphorylation of Agp1 and the phosphate- transfer to the response-regulator Rap1 could be demonstrated. Similar to cyanobacterial phytochromes, the phosphorylation was more pronounced in the Pr- than in the Pfr-form. Interestingly, the apoprotein was more phosphorylated than the holoprotein