Strukturaufklärung von alphaB-Kristallin

Advances in structural biology have been strongly supported by the success of three leading techniques: X-ray crystallography, solution NMR and Electron microscopy. These techniques are widely used for structure determination of proteins. Today, structure determination of non-crystalline solid protein preparations has been made possible through rapid progress of solid-state NMR methodology for biological systems. Castellani et. al. have solved and refined a first structure of a microcrystalline protein by using only solid-state MAS NMR spectroscopy. Its success relies on the perspective to access systems that are difficult to crystallise or that form large heterogeneous complexes and insoluble aggregates. Examples are ligands bound to membrane integrated receptors. Protein fibrils and heterogeneous proteins form another target for solid-state NMR. In this thesis, the structure of the a-crystallin domain of human aB crystallin (aB) is solved using solid-state NMR methodology. Atomic level structural information on aB, a prominent member of the small Heat Shock Protein (sHSP) family has been a challenge to obtain due its polydisperse, oligomeric nature. It is shown that magic-angle spinning solid-state NMR can be used to obtain high-resolution information on ~ 580 kDa human aB assembled from 175-residue, 20 kDa subunits. An ~90-residue a-crystallin domain is common to all sHSPs. Chemical shifts of the backbone and the Cb resonances have been obtained for residues 64-163 (a-crystallin domain plus part of the C-terminus) in aB and the isolated a-crystallin (aB10.1) domain by solid- and solution-state NMR, respectively. From the N-terminal domain 32 residues could be assigned by solid-state NMR. The presented data give a satisfactory description of the β-sandwich fold of the a-crystallin domain from full-length aB-crystallin oligomers. In the presented structure, the b-sandwich consists of six strands, three in each sheet. A majority of residues in the a-crystallin domain have similar chemical shifts in both solid- and solution- state indicating a similar structure for the domain in its isolated and oligomeric forms. Sites of inter-subunit interaction are identified from chemical shift differences that cluster to specific regions of the a-crystallin domain. Multiple signals are observed for the resonances of M68 in the oligomer, identifying the region containing this residue as existing in heterogeneous environments within aB. In addition intermolecular contact areas for the dimerisation and the interaction site of the C-terminal IXI-motif were pictured by using mixed-labelled oligomers. These data are a first move towards understanding the structure-function relationship of heterogeneous human sHSPs. Since solid-state NMR does not require rapid tumbling of proteins, there is no inherent limitation on the particle’s size. However, for large systems, the number of signals forms the bottleneck due to overlapping signals. To overcome this hurdle, methods for resolution enhancement are presented in this thesis. A simple spectroscopic filtering technique is presented that may aid the assignment of 13C and 15N resonances of methyl- containing amino acids in solid-state magic-angle spinning (MAS) NMR. A filtering block that selects methyl resonances is introduced in two- dimensional (2D) 13C-homonuclear and 15N-13C heteronuclear correlation experiments. As model systems, the a-spectrin SH3 domain and the outer membrane protein G of E. coli are used. In addition, these methods were shown to be valuable for the assignment of aB. As another resolution enhancement method, J-decoupling using refocusing pulses in the indirect dimension and MaxEnt reconstruction in the direct dimension is shown in this thesis. These techniques yield well-resolved spectra without sacrificing the signal to noise to an intolerable amount. Since MaxEnt is a post-acquisition processing method, existing data can be reprocessed and analysed in greater detail. MaxEnt reconstruction can be seen as a powerful and viable alternative to experimental approaches for J-decoupling. Finally, the approaches presented here will be applicable to a wide variety of dynamic complexes, opening new avenues for structural biology.Die Fortschritte in der Strukturbiologie sind im Wesentlichen auf die Anwendung dreier Techniken, der Röntgenkristallographie, der Lösungs-NMR und der Elektronenmikroskopie zurückzuführen. Diese Methoden sind weit verbreitet für die Strukturaufklärung von biologischen Systemen. Castellani et. al. haben als erste die Struktur eines mikrokristallinen Proteins mit Hilfe der Festkörper NMR Spektroskopie gelöst. Diese Technik ist vor allem deshalb so erfolgreich, weil sie Zugang zu Systemen ermöglicht, die nicht kristallisieren, große heterogene Komplexe oder unlösliche Aggregate bilden. Geeignete Systeme für die Festkörper NMR Spektroskopie sind beispielsweise Binder an Rezeptoren die in Membranen eingebettet sind, Protein-Fibrillen oder heterogene Biomoleküle. In dieser Doktorarbeit wird die Struktur der a-Kristallin Domäne von menschlichem aB-Kristallin (aB) mit Hilfe der Festkörper NMR Spektroskopie aufgeklärt. Wegen der polydispersen und oligomeren Eigenschaften von aB war es bis jetzt eine Herausforderung, Strukturinformationen auf atomarer Ebene von aB, einem bekannten Mitglied der kleinen Hitzeschock Protein-Familie (sHSP), zu erlangen. Es wird gezeigt, daß mittels Festkörper NMR Spektroskopie hoch aufgelöste Daten von aB, welches ~580 kDa große Oligomere aus 20 kDa Untereinheiten bildet, erhalten werden können. Eine ca. ~90 Reste umfassende a-Kristallin Domäne ist eine charakteristische Eigenschaft aller sHSPs. Mit Hilfe der Festkörper NMR Spektroskopie wurden die Signale der Reste 64-162 zugeordnet und von 32 Aminosäuren aus dem N-Terminus. Die chemischen Verschiebungen wurden mit denen der isolierten Domäne (Reste 64-152), welche mit Hilfe der Lösungs-NMR Spektroskopie erhalten wurden, verglichen. Die vorliegenden Daten beschreiben die b-Sandwich Faltung der a-Kristallin Domäne des vollständigen aB- Kristallins sehr gut. In der präsentierten Struktur, besteht das b-Sandwich aus zwei Faltblättern, die je aus drei Strängen zusammengesetzt sind. Die Mehrheit der Reste in der a-Kristallin Domäne zeigen eine ähnliche chemische Verschiebung bei der Messung mittels Festkörper NMR und Lösungs- NMR, was auf eine ähnlich Struktur der isolierten Domäne und der Domäne im Oligomer schließen läßt. Aus den systematischen Unterschieden der chemischen Verschiebungen in der a-Kristallin Domäne lassen sich Rückschlüsse auf die Interaktionsstellen der Untereinheiten ziehen. Für M68 werden mehrere Signalsätze beobachtet, was darauf schließen läßt, daß sich dieser Rest in einer heterogenen Umgebung im aB Oligomer befindet. Zusätzlich wurde ein Dimerisierungs-Modell und die intermolekulare Bindungsstelle des C-terminalen IXI-Motivs beschrieben. Hierzu wurden Oligomere hergestellt die aus unterschiedlich markierten Monomeren bestehen. Diese Daten sind der erste Schritt hin zum Verständnis des Struktur-Funktion Zusammenhanges von menschlichen heterogenen sHSPs. Molekularbewegung ist keine Bedingung für die Festkörper NMR Spektroskopie, deshalb gibt es keine Größenbegrenzung für die zu untersuchende Probe. Große Systeme führen jedoch zu einer hohen Anzahl an Signalen, und folglich zu nicht interpretierbaren Spektren. In dieser Doktorarbeit werden deshalb Methoden zur Verbesserung der Auflösung präsentiert, um diese Hürde zu überwinden. Es wird eine einfache Filter- Methode zur selektiven Anregung von Aminosäuren, die Methyl-Gruppen enthalten, vorgestellt. Diese Methode vereinfacht die Zuordnung von 13C- und 15N- Resonanzen dieser Gruppe von Aminosäuren in der Festkörper magic-angle spinning (MAS) NMR Spektroskopie. Ein für Methylgruppen selektiver Filterblock wird hierfür in 2D 13C homonukleare und 13C-15N heteronukleare Experimente eingebaut. Zur Entwicklung der Methode wurden die SH3 Domäne des a-Spektrins und das Außenmembran-Protein G von E. coli als Modelsysteme verwendet. Darüber hinaus wird gezeigt, daß die Filter-Methode einen wertvollen Beitrag bei der Resonanz-Zuordnung von aB leistet. Als weitere Methode zur Verbesserung der Auflösung wurde J-Entkopplung eingesetzt. Um die Auflösung in der indirekten Dimension zu verbessern wird ein Teil der Spins während der indirekten Evolutionszeit refokussiert. Um J-Kopplungen aus der direkten Dimension zu entfernen, werden die Daten mit der Methode der Maximalen Entropie (MaxEnt) prozessiert. Diese Methode liefert gut aufgelöste Spektren mit guten Signal zu Rausch Ausbeuten. Da die Methode der maximalen Entropie zum Prozessieren der Daten nach der Datenaufnahme eingesetzt wird, können bereits aufgenommene Daten erneut prozessiert werden und daraufhin detaillierter ausgewertet werden. Maximum Entropie Rekonstruktion kann als eine leistungsstarke und brauchbare Alternative zu experimenteller J-Entkopplung betrachtet werden. Die in dieser Doktorarbeit vorgestellten Methoden können auf eine Vielzahl von dynamischen Komplexen angewendet werden und öffnen neue Wege für die Strukturbiologie