The first three-dimensional structure of a toxin-antitoxin protein complex of plasmid stabilization systems

# Titelblatt # Vorwort # Einleitung > 1.1 Allgemeines > 1.2 Vererbung von Plasmid-DNA Molekularbiologischer Teil # 2 Material und Methoden > 2.1 Material > >> 2.1.1 Bakterienstämme > 2.1.2 Expressionsvektoren > 2.1.3 Primer (Oligonukleotide) > 2.1.4 Nährmedien zur Zellanzucht > 2.1.5 Pufferlösungen > > 2.2 Allgemeine Molekularbiologische Arbeitsmethoden > >> 2.2.1 Gelelektrophorese > 2.2.2 Molekularbiologische Reaktionsansätze # 3 Mutagenesestudien > 3.1 Klonierungsmethode > >> 3.1.1 Darstellung des Vektorkonstruktes > 3.1.2 Transformation > > 3.2 Klonierung > >> 3.2.1 Darstellung des Plasmidkonstrukts pe,zDQE601 > 3.2.2 Darstellung der Punktmutanten > 3.2.3 Darstellung der Valz234Stop Mutante # 4 Fermentation und Proteinisolierung > 4.1 Fermentation > >> 4.1.1 Zellanzucht in 2 X YT Medium > 4.1.2 Zellanzucht in NMM-Medium > > 4.2 Proteinisolierung > >> 4.2.1 Zellaufschluss und Ultrazentrifugation > 4.2.2 Reinigung des Wild-Typ Proteins und der Punktmutanten > 4.2.3 Aufreinigung des mutierten e,z(V234Stop) Proteinkomplexes > 4.2.4 Konzentrierung der Proteinlösungen > 4.2.5 Aufreinigung des Selenomethionin-derivatisierten Proteins > > 4.3 Materialcharakterisierung mittels MALDI-TOF Kristallographischer Teil # 5 Kristallisation > 5.1 Methode > 5.2 Kristallisationsbedingungen > >> 5.2.1 Kristallisation des Wild-Typ Proteins bei saurem pH-Wert > 5.2.2 Kristallisation des Wild-Typ Proteins bei neutralem pH-Wert > 5.2.3 Kristallisation des Selenomethionin-derivatisierten Proteins > 5.2.4 Kristallisation der punktmutierten Proteine > 5.2.5 Kristallisation des e,z(V234Stop) Proteins > 5.2.6 Kurioses # 6 Datensammlung und Derivatisierungsversuche > 6.1 Voruntersuchungen > 6.2 Cryoexperimente > 6.3 Polytypie > 6.4 Derivatisierungsversuche > 6.5 Datensammlung > >> 6.5.1 MAD-Datensammlung in Mod. I > 6.5.2 Datensammlung an nativen Kristallen > 6.5.3 Datensammlung an Schweratom-derivatisierten Kristallen > 6.5.4 Allgemeines zu Datensammlung # 7 Strukturlösung und Verfeinerung > 7.1 Methoden zum Lösen des Phasenproblems > >> 7.1.1 MAD (Multiple wavelength Anomalous Diffraction) > 7.1.2 Molekularer Ersatz mit AMoRe > > 7.2 Modellbau und Verfeinerung > >> 7.2.1 Berechnung der Elektronendichte und Dichtemodifikation > 7.2.2 Modellbau in Mod. I > 7.2.3 Verfeinerung > 7.2.4 Modellbau in Mod. IV und der Punktmutanten # 8 Ergebnisse der Strukturanalyse > 8.1 Mod. I > >> 8.1.1 Lösung des Phasenproblems > 8.1.2 Verfeinerung > > 8.2 Mod. III > >> 8.2.1 Lösung des Phasenproblems > > 8.3 Mod. IV > >> 8.3.1 Lösung des Phasenproblems > 8.3.2 Verfeinerung > > 8.4 Punktmutanten > >> 8.4.1 Verfeinerung > 8.4.2 Strahlungsschäden Strukturdiskussion # 9 Struktur des Wild-Typ Proteinkomplexes > 9.1 Hauptkettenverlauf und Tertiärstruktur > 9.2 Die Quartärstruktur des e2z2-Heterotetramers > 9.3 Vollständigkeit des Modells der verschiedenen Modifikationen > 9.3.1 Modell der Mod. I > 9.3.2 Modell der Mod. IV > 9.4 Kristallpackung > >> 9.4.1 Kristallpackung der Mod. I > 9.4.2 Kristallpackung der Mod. III > 9.4.3 Kristallpackung der Mod. IV > > 9.5 Vergleich der verschiedenen Modifikationen > 9.6 Temperaturfaktorverteilung der Mod. I > 9.7 Die P-Schleife > 9.8 Das gebundene Sulfat-Ion > 9.9 Die T-A-R-A-T Schleife > 9.10 Vergleich der Tertiärstruktur ( mit verwandten Strukturen > >> 9.10.1 Aspz67 und Gluz116 > 9.10.2 Lysz46 > 9.10.3 Thrz47 > 9.10.4 Argz158 > 9.10.5 Argz171 > > 9.11 Die inhibierte ATP-Bindungstasche > 9.12 Die Substratbindungstasche > 9.13 Der C-terminale Helix-Schleife-Helix Bereich > 9.14 Das Oberflächenpotential # 10 Die z(K46A) Mutante # 11 Die z(R171) Mutante Funktionsmechanismus Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Abkürzungen Chemikalien und Enzymbezugsregister Lebenslauf Veröffentlichungen DanksagungAufgabenstellung der vorliegenden Arbeit war die Ermittlung der dreidimensionalen Struktur des bakteriellen epsilon (e), zeta (z)-Antitoxin / Toxin-Proteinkomplexes (TA-System) kodiert auf dem Plasmid pSM19035 aus Streptococcus pyogenes. Das hier vorgestellte Strukturmodell ist die erste Struktur eines TA-Komplexes. Röntgenbeugungsdaten wurden an Selenomethionin- derivatisiertem Protein (max. Auflösung.: 3.10 Å) und Wild-Typ-Protein (max. Auflösung.: 1.95 Å) mit Synchrotronstrahlung gesammelt. Die Lösung des Phasenproblems erfolgte nach der MAD-Methode (Multiple wavelength Anomalous Diffraction). Die Gene e und z wurden in Escherichia coli in Methionin- oder Selenomethionin-haltigen Anzuchtsmedien exprimiert. Zur Reinigung des e,z Proteinkomplexes wurde ein Protokoll entwickelt und optimiert. Homogenes Protein wurde kristallisiert, an Kristallen wurden Beugungsdaten gesammelt. Nach Lösung des Phasenproblems mit MAD wurde ein Strukturmodell erstellt und verfeinert. Zusätzlich erfolgte auch die Lösung des Phasenproblems (mit der Methode des Molekularen Ersatzes) und anschließende Verfeinerung von Kristallstrukturen des Komplexes in zwei weiteren polymorphen (polytypen) Modifikationen. Die auftretenden Konformationsänderungen wurden als Packungseffekte identifiziert. Das Antitoxin ( neutralisiert im e2z2-Komplex die toxische Wirkung von z. Dies erfolgt mit Hilfe von Seitenketten der N-terminalen Helix a von e, welche durch sterische Hinderung und repulsive Wechselwirkungen einer ATP-Bindung von z entgegenwirken und das Protein somit inaktivieren. Die inaktive Form liegt in vivo solange vor, als die das Operon kodierenden Gene im Zellcytosol vorhanden sind. Strukturvergleiche mit in der Proteindatenbank (PDB) veröffentlichten Proteinen ergaben, dass das Protein z mit Phosphotransferasen strukturell verwandt ist, wenngleich nur sehr geringe Aminosäure-Sequenzidentität (max. 15 %) vorhanden ist. Dennoch wurden basierend auf diesen strukturellen Erkenntnissen in z katalytisch wichtige Aminosäuren identifiziert. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden zusätzlich zur gestellten Aufgabe ortsgerichtete Mutagenese-Studien und Strukturanalysen an diesen mutierten Proteinen durchgeführt. Alle Mutationen führten zu inaktivem, nicht-toxischem z Protein. Deshalb wird in dieser Arbeit eine Phosphotransferase-Aktivität als toxischer Effekt von z vorgeschlagen. Damit wird zum ersten Mal der Wirkungsmechanismus eines TA-Systems sowohl molekularbiologisch als auch strukturell untersucht.The aim of this work was the determination of the three dimensional structure of the bacterial epsilon (e), zeta (z) Toxin / Antitoxin complex (TA system) encoded by the plasmid pSM19035 of Streptococcus pyogenes. The described structural model is the first reported structure of a TA complex. X-ray diffraction data on crystals of a selenomethionine - derived protein (max. resolution: 3.10 Å) and the wild-type protein (max. resolution: 1.95 Å) were collected using synchrotron sources and the phase problem was solved utilising the Multiple wavelength Anomalous Diffraction (MAD) method. The genes encoding the antitoxin e and toxin z were transformed into E. coli and the proteins overproduced in methionine or selenomethionine containing media. A protocol for the purification of the protein complex was developed and optimised. Homogeneous protein complex e,z was crystallised and X-ray diffraction data collected. Following solution of the phase problem with MAD, a structural model was built and refined. Additionally, the phase problems of two further polymorphous modifications were solved and the structures refined. Apparent conformational changes were confirmed as effects of crystal packing. The short-lived antitoxin ( neutralises the toxic effects of z in the e2z2 complex. This is achieved by side chains of the N-terminal helix a of e, which blocks the putative ATP binding pocket z by steric hindrance and repulsive interactions, thereby inactivating the toxin. The inactive form exists in vivo as long as the gene encoding e is present and expressed in the cell cytosol. Structural comparisons with published proteins deposited in the Protein Database (PDB) revealed significant structural homology of z to phosphotransferases, although the sequence identity is low (max. 15%). Despite the latter, the structural information obtained permitted determination of the catalytically important residues in z. Expansion of the originally defined project involved site-directed mutagenesis studies and structural analysis of the resultant mutant proteins. All mutations of the putative catalytic residues produced inactive, non-toxic z protein, supporting the postulation that the toxic effect of z is caused by a phosphotransferase activity. This is the first account of utilisation of both molecular biological and protein structural methods to describe the functional mechanism of inactivation of a TA system