Identification and characterisation of enzymes that are associated with the COP9 signalosome

0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1\. Einleitung 1 1.1. Das COP9 Signalosom 3 1.2. Die Rolle des COP9 Signalosoms im Ubiquitin/26S-Proteasom-System 4 1.3. Die Proteinkinasen PKD und CK2 14 2\. Zielsetzung 23 3\. Ergebnisse 24 3.1. Das COP9 Signalosom besitzt eine Kinaseaktivität 24 3.2. Identifizierung der Kinasen während der Komplexisolierung 26 3.3. CK2 und PKD binden an das COP9 Signalosom 30 3.4. CK2 und PKD phosphorylieren CSN-Untereinheiten, p53 und c-Jun 33 3.5. Inhibitoren der Kinasen 37 3.6. Humanes Mdm2 wird durch die CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert 38 3.7. Mdm2 bindet an das COP9 Signalosom 39 3.8. Curcumin induziert die Auto-Ubiquitylierung von Mdm2 42 4\. Diskussion 45 4.1. Die Kinaseaktivität des COP9 Signalosoms 45 4.2. Die CSN-assoziierten Proteinkinasen CK2 und PKD regulieren den Proteinabbau über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System 53 4.3. Das COP9 Signalosom beeinflusst die Aktivität der Ubiquitin-Ligase Mdm2 55 4.4. Das COP9 Signalosom als Plattform für die Bildung von Ubiquitinkonjugaten 59 5\. Material und Methoden 63 5.1. Molekularbiologische Methoden 63 5.2. Proteinbiochemische Methoden 67 5.3. Zellkultur 77 6\. Zusammenfassung 79 7\. Referenzen 82 8\. Abkürzungen 94 9\. Appendix 97 9.1. Danksagung 97 9.2. Lebenslauf 98 9.3. Publikationen 99Das COP9 Signalosom (CSN) ist von Hefe bis zum Menschen konserviert und besteht aus acht Untereinheiten (CSN1-8). Der aus humanen Erythrocyten gereinigte CSN-Komplex besitzt Kinaseaktivität und phosphoryliert Proteine wie c-Jun und p53 mit Konsequenzen für ihren Ubiquitin-abhängigen Abbau. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die Proteinkinase CK2 und die Proteinkinase D (PKD) mit dem CSN-Komplex co-purifizieren. Die Bindung der beiden Kinasen an den Komplex konnte mit Immunopräzipitationen und Far-Westernblots sowohl in vitro als auch in Zellkultur nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische Untersuchungen mit einem gold-markierten ATP-Analogon weisen darauf hin, dass mindestens 10% der Komplexe mit Kinasen assoziiert sind. CK2 bindet an ΔCSN3(111-403) und CSN7, während PKD nur CSN3 bindet. Die PKD ist in der Lage CSN7 zu phosphorylieren, während die CK2 zusätzlich CSN2 phosphorylieren kann. In Kinase-Assays konnte gezeigt werden, dass c-Jun und p53 Substrate der beiden Kinasen sind. Durch die CK2-abhängige Phosphorylierung von p53 an Threonin 155 wird der Tumorsuppressor verstärkt über das Ubiquitin(Ub)/26S- Proteasom-System abgebaut. Curcumin, Emodin, DRB und Resveratrol blockieren die Komplex-assoziierte Kinaseaktivität und hemmen sowohl die CK2 als auch die PKD. Das Mdm2, eine Ubiquitin-Ligase, ist für den Abbau des Tumorsuppressors p53 verantwortlich. Immunopräzipitationen, Far-Westernblots und Immunofluoreszenzanalysen zeigen, dass das Onkoprotein an den CSN-Komplex bindet. Darüber hinaus wird das Mdm2 am Komplex phosphoryliert, höchstwahrscheinlich durch die CK2. Die Phosphorylierung wird dabei durch Curcumin inhibiert. Ferner konnte sowohl in Ubiquitylierungs-Assays als auch in MCF-7-Zellen gezeigt werden, dass Curcumin die Bildung von hochmolekularen Mdm2-Ubiquitin-Konjugaten induziert. Basierend auf diesen Daten kann ein Modell aufgestellt werden, in dem die Ubiquitin-Ligase Mdm2 und der p53-Abbau durch die CSN-assoziierten Kinasen reguliert werden. Durch Hemmung der gebundenen Kinasen wird das Mdm2 ubiquityliert, wahrscheinlich durch eine Stimulierung der Auto-Ubiquitylierungsaktivität, und dies führt in der Folge zu einem proteasomalen Abbau von Mdm2. Mit anderen Worten: Die Phosphorylierung von Mdm2 hemmt die Auto-Ubiquitylierung. Das COP9 Signalosom dient somit als Plattform für die Regulation von Ubiquitin-Ligasen und des Proteinabbaus durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System.The COP9 signalosome (CSN) is conserved from yeast to man and consists of eight subunits (CSN1-8). The purified CSN complex from human erythrocytes possesses kinase activity that phosphorylates proteins such as c-Jun and p53 with consequences for their ubiquitin (Ub) dependent degradation. In this study it is shown that the protein kinase CK2 and the protein kinase D (PKD) co-purify with the CSN. The association of these kinases with the complex was demonstrated by far-western blots and by immunoprecipitation in vitro and in cell culture experiments. As indicated by electron microscopy with a gold- labelled ATP-analogue, at least 10% of CSN particles are associated with kinases. CK2 binds to ΔCSN3(111-403) and CSN7, whereas PKD interacts only with full-length CSN3. The PKD modifies CSN7 while the CK2 also phosphorylates the CSN2 subunit. In kinase assays both kinases phosphorylate recombinant c-Jun and p53. The phosphorylation of p53 at Thr155 by the CK2 targets the tumour suppressor to degradation by the Ub/26S proteasome system. Curcumin, emodin, DRB and resveratrol block CSN-associated kinases and also inhibit the CK2 and PKD. The oncoprotein Mdm2, a RING finger ubiquitin ligase, is responsible for the ubiquitylation of the tumour suppressor p53. By far-western blots, immunoprecipitation experiments and immunofluorescence analysis it is shown that Mdm2 binds to the CSN complex in vitro and in cell culture experiments. Mdm2 is phosphorylated by the CSN-associated kinases, most likely by the CK2. The phosphorylation is inhibited by curcumin. In addition, curcumin induces the formation of high molecular weight Mdm2 ubiquitin conjugates in vitro and in MCF-7 cells. Based on these data we propose a model in which the Ub ligase Mdm2 and the degradation of p53 are regulated by the CSN-associated kinases. Inhibition of the kinases causes Mdm2 ubiquitin conjugate formation, most likely by stimulation of the auto-ubiquitylation activity, followed by the degradation of Mdm2. In other words, the phosphorylation by the CSN-associated kinases prevents the auto-ubiquitylation of Mdm2. Thus the COP9 signalosome serves as a scaffolding platform that regulates ubiquitin ligases and protein degradation via the Ub/26S proteasome system