Control, use and misuse of cellular signalling networks

Les interactions protéine-protéine sont au centre de la signalisation cellulaire. Les MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) sont une famille de protéines kinases intracellulaires qui forment des cascades de signalisation contrôlant des mécanismes cellulaires fondamentaux tels que la prolifération, la différenciation, l'inflammation et la mort cellulaire. Les signaux progressent à travers différentes kinases (MAP4K, MAP3K et MAP2K) qui finissent par activer une MAPK. L'activation des MAPKs se fait par la double phosphorylation d'un motif TxY situé dans sa boucle d'activation, et module l'expression de gènes par l'intermédiaire de facteurs de transcription ou d'autres protéines kinases. La spécificité de liaison des MAP2Ks aux MAPKs est médiée par des motifs nommés KIM (pour Kinase Interacting Motif). Il existe de nombreuses structures aux rayons X des kinases individuelles et en complexe avec des KIMs isolés. Cependant, en raison de la nature transitoire de l'interaction entre les kinases, les détails moléculaires de la sélectivité et de l'activation d'une MAPK par sa MAP2K sont inconnus.Deux membres importants de la famille MAPK impliqués dans la réponse inflammatoire sont p38α, une MAPK, et sa MAP2K activatrice, MKK6. A travers eux, nous présentons le premier modèle de l'interaction entre une MAPK et sa MAP2K activatrice amont piégée à l'état de transition. Le modèle révèle un dimère de kinases face à face permettant à la boucle d'activation de p38α d'accéder au site actif de MKK6. La plupart des interactions sont éloignées par rapport aux sites de phosphorylation. En plus de l'interaction bien caractérisée entre le KIM de la MAPK2K et le "docking site" de la MAPK, une nouvelle interface d'interaction entre les lobes C des deux kinases a été indentifiée. Cette configuration jusqu'alors inobservée est favorable à la catalyse et, malgré sa résolution limitée, le modèle cryoEM de MKK6 et p38α ouvre la voie à des hypothèses sur l'activation des MAPK.Nous avons également découvert un nouveau mécanisme de phosphorylation non canonique de p38α par MKK6 utilisant l'ADP comme source de phosphate. Nous montrons que MKK6 est capable de phosphoryler p38α en utilisant le β-phosphate de l'ADP et de l'ATP in vitro, avec une efficacité moindre qu'avec l'hydrolyse canonique du γ-phosphate de l'ATP. Cette voie alternative de phosphorylation pourrait conférer un avantage adaptatif au stress en cas de privation d'ATP pour maintenir la voie de signalisation.Certains pathogènes détournent les voies de signalisation de leur hôte pour remodeler la réponse cellulaire à leur avantage. Le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii sécrète des protéines effectrices qui imitent des motifs présents dans certaines protéines de l'hôte pour agir directement sur leurs cibles. Nous avons caractérisé comment deux effecteurs de T. gondii, GRA24 et GRA16, interagissent avec leur protéine cible.GRA24 se lie aux MAPKs de l’hôte p38α et ERK1/2 par le biais d'un motif KIM ; et GRA16 interagit avec la déubiquitinase hôte USP7 par le biais d'un motif de liaison MATH. Les deux motifs ont une haute affinité pour leur cible et se lient à des sites d’interaction connus en compétition avec les interacteurs de l'hôte. Nous présentons les détails moléculaires de l'interaction entre ces motifs pathogènes et leur cible et proposons un mécanisme d'action potentiel.Protein-protein interactions are at the centre of cell signalling. The MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) are a family of intracellular protein kinases that form signalling cascades that control fundamental cell mechanisms such as proliferation, differentiation, inflammation and cell death. Signals progress through kinases (MAP4K to MAP3K to MAP2K) which eventually activate a MAPK. MAPK activation is achieved through the double phosphorylation of a TxY motif in its activation loop, and modulates the expression of genes through transcription factors or other protein kinases. The docking specificity of MAP2Ks towards MAPKs is mediated by Kinase Interacting Motifs (KIMs). Many X-ray structures exist of the individual kinases and complexes with isolated KIMs. However, due to the transient nature of the interaction between kinases, the molecular details of selectivity and activation of a MAPK by its upstream component are unknown.Two important members of the MAPK family involved in the inflammatory response are p38α, a MAPK, and its activating MAP2K, MKK6. Through them, we present the first model of the interaction between a MAPK and its upstream activating MAP2K trapped in transition state. The model reveals a face-to-face heterokinase dimer, allowing the activation loop of p38α to access the active site of MKK6. Most interactions are distal from the phosphorylation sites, including the well-characterised MAP2K KIM – MAPK docking site interaction and a novel interaction interface between the C-lobes of the two kinases. This previously unobserved configuration is favourable for catalysis, and, despite its limited resolution, the cryoEM structure of MKK6 and p38α paves the way for hypotheses on MAPK activation.We also discovered a novel non-canonical phosphorylation mechanism of p38α by MKK6 using ADP as a source of phosphate. We show that MKK6 is able to phosphorylate p38α using the β-phosphate of ADP and ATP in vitro, with lower efficiency than with the canonical hydrolysis of γ-phosphate of ATP. This alternative route of phosphorylation could confer an adaptive advantage to stress in case of ATP deprivation to maintain the signalling pathway.Some pathogens hijack host signalling pathways, such as the MAPK pathway, to remodel the cellular response to their advantage. The intracellular parasite Toxoplasma gondii secretes effector proteins that mimic motifs present in some host proteins to directly act on their targets. We characterized how two of T. gondii effectors, GRA24 and GRA16, interact with their target protein.GRA24 binds the host MAPKs p38α and ERK1/2 through a KIM motif; and GRA16 interacts with the host USP7 deubiquitinase through a MATH binding motif. Both motifs have high affinity for their targets and bind to known docking sites in competition with host interactors. We present the molecular details of the interaction between these pathogen motifs, and their host target, and propose some potential mechanism of action