Time-resolved fluorescence spectroscopic studies at the cytoplasmic surface of rhodopsin

In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an der cytoplasmatischen Oberfläche des lichtsensitiven Sehpigments Rhodopsin durchgeführt. Diese Rezeptoroberfläche spielt eine entscheidende Rolle bei der Rezeptoraktivität, da sich dort nach Aktivierung der Lichtantenne - dem Liganden Retinal - die Rezeptorkonformationen manifestieren, die zur Bindung des G-Proteins Transducin und des Inhibitorproteins Arrestin führen. Ziel der Arbeit war es, die Dynamik und die Änderungen der Umgebungsparameter an der cytoplasmatischen Oberfläche in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern zu bestimmen. Dazu wurden Fluoreszenzanisotropieexperimente mit einem an der amphiphatischen Helix 8 an Position Cys316 gebundenen Fluorescein durchgeführt. Über eine Analyse der Fluoreszenzanisotropiekurven mit Hilfe der Ordnungsparameter und konnte ein direkter Zusammenhang zwischen dem Bewegungsmodell von Helix 8, dem Rezeptorzustand, welcher unter anderem von pH und Temperatur abhängig ist, und der Proteinumgebung ermittelt werden. Im Zuge der Arbeit wurde eine zeitkorrelierte Einzelphotonenzählungs (TCSPC)-Apparatur zur Detektion zeitaufgelöster Fluoreszenz- und Dynamikänderungen zu einer multidimensionalen TCSPC-Apparatur für Fluoreszenz Pump-Probe Messungen ausgebaut. Damit können nun zeitaufgelöste Fluoreszenz- und Dynamikänderungen in Abhängigkeit der Proteinfunktion detektiert werden. Die Proteinreaktion wird durch einen Farbstofflaser angeregt. Auf der Zeitachse der Proteinreaktion werden dann sequenziell Pikosekunden-zeitaufgelöste Fluoreszenzzerfallskurven aufgenommen, die es erlauben, die Veränderung der Nanosekunden-Oberflächendynamik zu verfolgen. Zum automatisierten Austausch der Probe wurde eine Flußzelle in den Aufbau integriert. Mit dieser Apparatur wurde die Kinetik der Bindung des G-Proteins Transducin an den Sehrezeptor Rhodopsin mit Hilfe eines in der Arbeitsgruppe neuentwickelten, fluoreszenzbasierten Helix-Faltungs-Sensors untersucht, welches dem C-terminalen Ende der katalytischen Alpha-Untereinheit des Transducins entspricht. Dieses C-terminale Ende der Alpha-Untereinheit gehört zu den drei Bindungsankern des Transducins und bindet spezifisch an den aktivierten Rezeptor. Es konnte damit gezeigt werden, daß die Kinetik der Bindung des Peptides an das lichtaktivierte Rhodopsin zweistufig ist. Der erste Schritt - die Vorbindung - findet in Membranumgebung vor der Ausbildung des aktiven Meta-II Intermediats von Rhodopsin statt. Der zweite Schritt - die Helixbildung des Sensors durch die Änderung der Konformation an der cytoplasmatischen Oberfläche - findet nach der Ausbildung von Meta-II statt. Ebenfalls wurde ein Mikroskopaufbau zur Messung der internen Totalreflektionsfluoreszenz (TIRF) in der Arbeitsgruppe etabliert, mit dessen Hilfe die Diffusion von einzelnen lichtaktivierten Rhodopsinmolekülen in nativen Diskmembranfragmenten untersucht wurde. Es konnte damit ein heterogenes Diffusionsverhalten der lichtaktivierten Rhodopsinmoleküle in nativen Membranen nachgewiesen werden. Ein Teil der Moleküle ist wahrscheinlich in Oligomeren organisiert und diffundiert langsam über die Diskmembran. Der andere Teil der Moleküle bewegt sich in kleineren Einheiten mit einer höheren Diffusionsrate über die Diskmembran. Zusätzlich ist eine Einschränkung der Diffusion auf Bereiche zu erkennen, welche der Größe der gemessenen Diskmembranfragmente entsprechen.The cytoplasmic surface of the G-Protein coupled receptor rhodopsin plays a crucial role in the process of vision. The activation of rhodopsin is triggered by a photon, which is absorbed by the ligand, the retinal. The accompanying conformational changes of the protein are reflected on the protein surface. They lead to binding of the G-Protein transducin - which starts the visual cascade - and also of the protein arrestin - which terminates the visual cascade. The aim of this work was to analyse the changes of rhodopsins cytoplasmic surface in dependence of several parameters such as pH, temperature and activation state. Therefore we performed fluorescence anisotropy measurements on the fluorescent dye fluorescein covalently bound to the amphiphatic helix 8 at position Cys316 of rhodopsin. The examination of the time-resolved fluroescence decay curves via order parameters and showed a direct correlation between the pH and temperature-dependent receptor state and the distribution model of helix 8, which itself depends on the protein environment. In this work, a time correlated single photon counting (TCSPC)-apparatus was extended to a multi dimensional pump-probe setup to measure time-resolved fluorescence and dynamic changes along the reaction coordinate of protein function. A dye laser triggers the protein function (pump) and a laser with picosecond pulses excites the fluorescent dye (probe). The fluorescence decay curves are recorded sequencially along the reaction coordinate of the protein. The decay curves allow the analysis of the protein nanosecond surface dynamics. With this setup we measured the binding kinetics of transducin to light activated rhodopsin with a newly developed, fluorescence based helix folding sensor. This sensor has an amino acid sequence similar to the native C-terminus of the transducin alpha-subunit, which is one of the three transducin anchors, and can specifically bind to light activated rhodopsin (metarhodopsin-II). We could show for the first time, that binding occurs via a two-step mechanism in native membranes. The prebinding is the first step. In comparison with time correlated absorption measurements prebinding is faster than the formation of the active metarhodopsin-II state. The second step is called final binding and is characterized by formation of an alpha-helical structure. This structural change is induced due to conformational changes at the cytoplasmic surface of the light activated rhodopsin and is much slower than formation of metarhodopsin-II. Measurements of the diffusion of individual light activated rhodopsin molecules in native membrane fragments on a TIRF-microscope are also presented in this work. We were able to identify a heterogeneous diffusion behaviour of slow and fast diffusing rhodopsin molecules in the membrane. The slowly diffusing fraction was assigned to oligomeres of rhodopsin organized in patches and the fast diffusing molecules to smaller units (possibly mono- or dimers) of rhodopsin. The diffusion is restricted to an area, which is comparable to the size of the disk-membrane patches used in these experiments