Functional selectivity of G-Protein coupled receptors with a role in energy homeostasis

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind an der Steuerung aller grundlegenden Zell- und Körperfunktionen wie Metabolismus, Zelldifferenzierung und Wachstum beteiligt. Die Eigenschaften und Mechanismen der GPCRs sind komplex, wobei jeder einzelne Rezeptor individuell zu betrachten und im Zusammenhang zu untersuchen ist. In dieser Arbeit wurden Rezeptoren erforscht, die insbesondere in der Energiehomöostase eine Rolle spielen und Lücken im Verständnis ihrer Funktionalität aufweisen. Der Fokus wurde auf fünf ausgewählte GPCRs gelegt, den G-Protein gekoppelten Rezeptor 83 (GPR 83), den Melanocortin-4 Rezeptor (MC4R), die beta-adrenergen Rezeptoren 1 und 2 (ADRB1 und ADRB2), sowie den Trace amine-assoziierten Rezeptor 1 (TAAR1). Es sollten Signalwege des orphanen (Ligand unbekannt) GPR83, Interaktions- Regulationsmechanismen des wichtigsten GPCR in der Appetitregulation - MC4R, sowie dfferentielle Signalisierungsmodulationen an ADRB1 und ADRB2 untersucht werden. Im Rahmen der genannten Projekte und der hier aufgeführten resultierenden Publikationen wurden die wichtigsten Signalwege funktionell mittels zellbasierter Stimulationsversuche charakterisiert. Zum anderen wurden GPCR-GPCR Interaktionen durch die Methode des Sandwich-ELISA überprüft. Die Untersuchungen zeigten, dass der GPR83 im Zusammenspiel mit Zink (II) den Gq/11-Signalweg aktiviert, basal aktiv (Liganden unabhängig) ist, sich für Gq/11 durch bestimmte Mutationen auch konstitutiv aktivieren lässt und als Homodimer vorliegt. Durch die Studien zum MC4R konnte festgestellt werden, dass die intrazelluläre Schleife 2 und Teile der verbundenen Transmembranhelizes 3 und 4 zur Bildung von MC4R-Homodimeren essentiell sind. Durch eine gezielte Separierung des Homodimers durch Modifikationen an diesen Komponenten wurde eine gesteigerte Liganden unabhängige Basalaktivität erzeugt, was auf einen inhibitorischen Einfluss durch die Dimerisierung schlieÿen lässt. Die Spurenamine Tyramin, beta-Phenylethylamin und Octopamin sind nicht nur Agonisten des TAAR1, sondern wirken auch als partielle Antagonisten oder Agonisten an ADRB1 und ADRB2. Die differentielle Modulation zeigte sich entweder in einer Blockade oder in einer Aktivierung des Gs- Signalweges. Strukturmodellbetrachtungen im Zusammenspiel mit den funktionellen Daten führten zu der Schlussfolgerung, dass die gemeinsamen Liganden von TAAR1, ADRB1 und ADRB2 aufgrund einer hohen Aminosäureähnlichkeit in einer bestimmten Ligandenbindungsregion lokalisiert sind und ortho- oder allosterisch wirken. Zusammenfassend führten alle drei Hauptprojekte zu neuen Erkenntnissen, auf die in weiteren Studien aufgebaut werden kann. Es wurden insbesondere neue Details zur funktionellen Selektivität von GPCRs in der komplexen Regulation gezeigt, die nicht zuletzt helfen können, in das Problem des zunehmenden Übergewichts weiter Teile der Weltbevölkerung zielgerichtet und selektiv pharmakologisch einzugreifen.G-protein coupled receptors (GPCRs) are involved in the control of all basic cellular and physiological functions such as metabolism, cell differentiation and growth. The characteristics and mechanisms of GPCRs are complex, while each individual receptor needs to be investigated individually and considered in context to each other. Within this paper receptors were ascertained which are particularly involved in the energy homeostasis but which still hold gaps in understanding their functionality. The focus was placed on five selected GPCRs, the G-protein coupled receptor 83 (GPR 83), the melanocortin-4 receptor (MC4R), the beta-adrenergic receptors 1 and 2 (ADRB1 and ADRB2), and the trace amine-associated receptor 1 (TAAR1). The aim was to unravel signaling pathways of the orphan (ligand unknown) GPR83, regulatory interaction mechanisms of the most important GPCR in appetite regulation of the MC4R, and differential signaling modulations of ADRB1 and ADRB2. In the scope of these projects and the resulting publications listed here the most important signaling pathways were functionally characterized using cell-based stimulation assays. On the other hand GPCR-GPCR interactions were investigated using a sandwich-ELISA approach. The investigations showed that the GPR83 is activated in combination with zinc (II) in the Gq/11-signaling pathway, is basally active (ligand independent), can be activated constitutively for Gq/11 by a certain mutation, and moreover is present as homodimer. Through the MC4R studies it was shown that the intracellular loop 2 and parts of the conjoined transmembrane helices 3 and 4 are essential for MC4R homodimer formation. Modifications of these components led to a selective separation of the homodimers and increased the ligand independent basal activity suggesting an inhibitory influence by the dimerization. The trace amines tyramine, beta-phenylethylamine and octopamine are not only agonists at TAAR1, but also act as partial antagonists or agonists at ADRB1 and ADRB2. The differential modulation was exhibited in either a blockade or an activation of the Gs-signaling pathway. Consideration of structure models in combination with the obtained functional data led to the conclusion that the shared ligands of TAAR1, ADRB1 and ADRB2 are localized in a specific ligand binding region due to their high amino acid similarity, thus acting ortho- or allosterically. In summary, all three main projects led to new insights providing information and knowledge for further studies. New details unraveling the functional selectivity of GPCRs in the complex regulation are shown which may help to reduce the increasing obesity as problem of the world population by intervening with selective pharmaceuticals